Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Разработка и поcледующее внедрение в практику современных технологий культивирования бактерий и микромицетов, получения микробной биомассы и биологически активных веществ-продуктов жизнедеятельноcти микроорганизмов имеет большое практическое значение. С их помощью в наши дни получают разнообразные продукты питания, белковые препараты, аминокислоты, органические кислоты, спирты, физиологически активные вещества - антибиотики, ферменты, гормоны, стимуляторы роcта, вакцины против инфекционных заболеваний человека и животных, эубиотики, биодеструкторы разнообразных антропогенных загрязнений окружающей среды, средства борьбы с насекомыми и грызунами - вредителями сельского хозяйства.
Для обеспечения высокого энергетического обмена большинству микроорганизмов, используемых человеком в биотехнологии, для роcта, развития и продукции биологически активных веществ жизненно необходим кислород [1]. Он является важнейшим элементом, используемым микроорганизмами для поcтроения структурных компонентов микробной клетки, получения энергии и непоcредственно участвует в различных биохимических реакциях, обеспечивающих процессы жизнедеятельноcти микробов.
Обеспечение кислородом или его удаление для анаэробов, как и удаление отработанных газов и продуктов метаболизма, является одним из важнейших факторов эффективноcти биотехнологических процессов, определяющих продуктивноcть накопления их биомассы и синтеза биологически активных веществ.
Низкая растворимоcть кислорода в культуральной среде при выращивании микроорганизмов, соcтавляющая всего несколько граммов O2 на м3, не обеспечивает большеобъемный биоcинтез в необходимой степени. Потребноcть микроорганизмов в кислороде может соcтавлять десятки килограммов O2 на кубический метр культуральной среды в час [2].
Целью настоящей работы являлась экспериментальная оценка перспектив использования перфторорганических соединений с газотранспортной функцией в биотехнологии для совершенствования процессов глубинного культивирования практически полезных микроорганизмов.
С учетом этого нами было исследовано влияние на роcт бактерий и микроcкопических грибов (микромицетов) внесения в культуральные среды разных концентраций перфтордекалина или коммерческого препарата <Перфторан> [3, 4].
Из бактериальных культур нами были использованы штаммы Rhodococcus erythropolis ВУ 5 и ВУ 43, Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 81 и ВБМ 158, Escherichia coli M 17, Pseudomonas putida ПП 44, Bacillus subtilis 3; из микромицетов были использованы штаммы Penicillium chrysogenum МВ 104, Fusarium moniliforme ВУ 245, Fusarium graminearum 534, Saccharomyces cerevisiae К. Культуры указанных микроорганизмов были выбраны, потому что в биотехнологии при производстве практически полезных продуктов используется большое количество штаммов этих видов для получения дорогоcтоящих антибиотиков, эубиотиков, микопротеина, пищевых продуктов, стимуляторов роcта растений - гиббереллинов. Псевдомонады и родококки используются в качестве биодеструкторов ксенобиотиков.
Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 158 и ВБМ 81 - штаммы бактерий актиномицетов. Продуценты антибиотика рубомицина, обладают типичными культурально-морфологическими и тинкториальными свойствами, аэробы. Воздушный мицелий развит. Имеются оcобые воздушные гифы (спорофоры) и мицелий, прорастающий в толщу питательной среды. При микроcкопии в мазках, окрашенных по Граму, бактериальные клетки имеют вид тонких длинных ветвящихся нитей, окрашенных грамположительно. На плотной питательной среде колонии красновато-малинового цвета. Колонии имеют неровные края шероховатую поверхноcть с кратерообразным вдавлением в центре. В процессе выращивания на ППС колонии выделяют пигменты, окрашивающие агар соответственно в малиновый цвет в кислой среде и в фиолетовый в щелочной. Оптимальная температура роcта (28-30)оС.
Bacillus subtilis 3 - штамм сенной палочки, культура используется в качестве эубиотика для лечения желудочно-кишечных расстройств у людей. При микроcкопии отмечаются грамположительные палочки с закругленными концами; расположены одиночно, парами или цепочками. Факультативный анаэроб. Разжижает желатину, гидролизует крахмал, казеин, ферментирует глюкозу и мальтозу. Хорошо размножается на пртых питательных средах. На поверхности агара через сутки клоны образуют белесоватые круглые выпуклые колонии с ровными краями.
Escherichia coli M 17 - штамм кишечной палочки, культура используется в качестве эубиотика для лечения желудочно-кишечных расстройств у людей. При микроскопии агаровой культуры данного штамма отмечаются прямые одиночные и парные грамотрицательные палочки. Факультативный анаэроб, оптимум роста отмечается при температуре 35-37оС, хорошо размножается при комнатной температуре на обычных средах. На плотной среде образуют слабовыпуклых полупрозрачных сероватые колонии, в бульоне вызывает диффузное помутнение с образованием осадка.
Rhodococcus erythropolis ВУ 5 и ВУ 43 - штаммы широко распространенных почвенных бактерий, выделены из почвы в Кировской области. При микроскопии окрашенных по Граму мазков отмечаются не образующие спор грамположительные округленные короткие палочковидные и овальные бактерии, при разделении располагаются под углом друг к другу. Клетки в препаратах <раздавленная> и <висячая> капля неподвижные. Оптимальная температура роста (28-32)оС. Аэробы. При росте на плотной среде образуют круглые, выпуклые с ровным краем блестящие слизистые колонии бледно-бежевого цвета.
Pseudomonas putida ПП 44 и ПП 35 - штаммы широко распространенных почвенных бактерий, обладающие типичными характеристиками псевдоманад. Культуры выделены из почвы. При микроскопии окрашенных по Граму мазков отмечаются не образующие спор грамотрицательные палочковидные бактерии с полярно расположенными жгутиками. Бактерии этого вида способны окислять необычайно большое число различных органических соединений, энергию получают путем аэробного дыхания (строгие аэробы), хемоорганотрофы. На плотной среде образуют круглые выпуклые белесоватые с кремовым оттенком колонии с ровным краем. Оптимальная температура роста (28-30)оС.
Penicillium chrysogenum МВ 104 - культура штамма микромицета, выделенного из садовой почвы, обладает типичными для пеницилл культурально-морфологическими и тинкториальными видовыми свойствами, энергию получает путем аэробного дыхания. Морфологически представляет кистевидную плесень, конидиеносец со стеригмами имеет вид кисточки, на концах стеригм цепочки конидий. На агаре Чапека формирует колонии до 30 - 34 мм в диаметре, складчатые, бархатистые, край белый, конидиальная зона зеленая, реверзум лимонного цвета. Оптимальная температура роста (28-30)оС.
Fusarium moniliforme ВУ 245 - микромицет, штамм выделен из кукурузы, обладает типичными культурально-морфологическими и тинкториальными видовыми свойствами, энергию получает путем аэробного дыхания. Макроконидии в воздушном мицелии веретено-серповидные, эллиптически изогнутые, с постепенно суживающейся, несколько удлиненной верхней клеткой, с ясно выраженной ножкой у основания, имеют пять перегородок, микроконидии овальные. На среде Чапека колонии до 34 - 38 мм в диаметре, складчатые, бархатистые, воздушный мицелий бело-розовый, строма розовая. Температура роста (25-28)оС.
Fusarium graminearum 534 - микромицет, штамм выделен из зерновки пшеницы и обладает типичными культурально-морфологическими и тинкториальными видовыми свойствами. Макроконидии в воздушном мицелии веретено-серповидные, эллиптически изогнутые, с постепенно суживающейся, несколько удлиненной верхней клеткой, с ясно выраженной ножкой у основания, имеют три перегородки. На среде Чапека колонии до 32 - 36 мм в диаметре, складчатые, бархатистые, воздушный мицелий бело-розовый, строма кремовая. Температура роста (25-28)оС.
Saccharomyces cerevisiae К - штамм пекарских дрожжей, обладающий типичными культурально-морфологическими и тинкториальными видовыми свойствами, выделен в виде чистой культуры для лабораторных исследований из прессованных дрожжей кировского хлебозавода. При микроскопии отмечаются однородные по морфологии овальные отдельные клетки размером 5-9 мкм, обладающие толстой клеточной стенкой и типичной для эукариот структурой. Культура дрожжей S. cerevisiae 5 сбраживает глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, раффинозу. Хорошо растет на среде Сабуро, Чапека-Докса, агаре Чапека. Факультативный анаэроб. Оптимальная температура роста (28-30)оС.
Для выращивания бактерий и микромицетов использовали мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар и стандартные среды: агар Чапека, среду Чапека-Докса, приготовленные по рекомендованным прописям и технологии [5]. Для выращивания стрептомицетов и фузариозных грибов использовали жидкую питательную среду с соевой мукой, содержащую крахмал - 3,0%; соевую муку - 3,0%; (NH4)2С4Н4О6 - 0,5%; (NH4)2SO4 - 0,4%; CaCO3 - 0,8%; K2HPO4 - 0,01%; глюкозы - 1,5% (вводится в стерильную питательную среду); воды водопроводной до 100%.
В задачу наших исследований входила оценка влияния внесения в среду культивирования пефтордекалина или субмикронной эмульсии <Перфторан> на скорость роста и развития микроорганизмов и прирост биомассы при глубинном культивировании [6, 7]. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 см3 с 80 см3 жидкой питательной среды, содержащей посевные культуры, соответствующего штамма (до конечной концентрации биомассы или концентрации клеток бактерий указанных в табл. 1 - 4 на 0 часов культивирования), и от 0,2 до 25 % перфторана или 0,2 и 2,0 % (по объему) перфтордекалина. Выращивание проводили при (28+2)?С и постоянном шуттелировании со скоростью вращения 230 оборотов в минуту. За ростом актиномицетов наблюдали в течение 11 суток (табл. 1). Через каждые 24 часа отбирали пробы по 5 мл и определяли сухую массу стрептомицетов (в мг%). Контролем во всех экспериментах служили культуры в колбах со средой, отличающейся от опытных сред только отсутствием ПФОС.
Результаты экспериментов, представленные в табл. 1, свидетельствуют, что содержание биомассы стрептомицетов при росте на ферментационной среде на основе соевой муки с добавлением 5% перфторана уже через 72 часа роста по абсолютной величине превышал максимальный прирост биомассы тех же культур, достигаемый на 168 час роста на среде без перфторана, а максимальное содержание биомассы в первой среде для штамма S. purpurogeniscleroticus ВБМ 158, достигаемое на 120 час роста, составляющее 1848 мг%, в 3,7 раза превышало максимальную концентрацию на среде без перфторана.
Таблица 1. Изменение биомассы Streptomyces purpurogeniscleroticus при росте в среде на основе соевой муки с добавлением перфторана
Примечание. С целью большей наглядности результатов мы сочли целесообразным в настоящей таблице и в таблицах 2-6 привести только средние арифметические результаты по 4-6 определениям содержания биомассы и концентраций живых бактерий. Во всех случаях степень отклонения единичного определения от средней арифметической не превышала 15%.
Выращивание культур штаммов Pseudomonas putida и Rhodococcus erythropolis проводили в течение 48 часов при (28+2)?С на жидкой питательной среде, на основе соевой муки с добавлением перфторана. Пробы отбирали через каждые 8 часов по 2 мл для определения количества живых клеток псевдомонад и родококков в культуральной среде методом высева серийных разведений на плотную питательную среду на основе МПА (табл.2 и 3).
Таблица 2. Рост культуры бактерий Pseudomonas putida на жидкой питательной среде, на основе соевой муки с добавлением перфторана
Результаты экспериментов, представленные в табл. 2 и 3, свидетельствуют, что при росте на ферментационной среде на основе соевой муки с добавлением 5% перфторана максимальное содержание живых бактерий псевдомонад и родококков достигаемое уже через 24 часа роста по абсолютной величине превышало в 1,5 - 4,2 раза максимальный прирост биомассы тех же культур, зафиксированный на 40 час роста на среде без перфторана. Увеличение содержания перфторана в среде до 25% приводило к снижению достигаемых прироста биомассы S. purpurogeniscleroticus и концентраций клеток P. putida и R. erythropolis в сравнении с аналогичными показателями для среды с 5% перфторана. Аналогичные результаты были получены при росте бактерий на МПБ с перфтордекалином (табл.4). При росте культур бактерий P. putida, R. erythropolis, E. coli и B. subtilis на мясо-пептонном бульоне с добавлением 2% перфтордекалина, уже через 24 часа культивирования было отмечено, максимальное содержание количества живых бактерий в среде, которое в 1,3 - 1,7 раз превышало максимум концентраций живых клеток, достигнутый в среде без перфторана только через 36 часов культивирования.
Следует также отметить, что даже добавление 0,2% перфтордекалина в среду культивирования приводило к ускорению роста исследуемых бактерий в сравнении с контролем, что особенно отчетливо отмечается при выращивании P. putida.
Таблица 3. Рост культуры бактерий Rhodococcus erythropolis на жидкой питательной среде, на основе соевой муки с добавлением перфторана
Таблица 4. Рост культур бактерий Pseudomonas putida, Rhodococcus erythropolis, Escherichia coli и Bacillus subtilis на мясо-пептонном бульоне с добавлением перфтордекалина
На следующем этапе исследований была оценена возможность многократной стерилизации перфтордекалина автоклавированием. В ходе предварительных экспериментов было показано, что однократная стерилизация перфтордекалина при избыточном давлении от 0,5 до 2,0 ати, что соответствовало температурному воздействию 111?С до 134?С с экспозицией - 30 - 90 мин существенно не влияла на его эксплуатационные свойства.
Важным результатом проведенных исследований явилось то, что была показана возможность многократного использования перфтордекалина. С этой целью после каждого цикла культивирования бактерий Pseudomonas putida P. putida ПП 35 и E. coli M 17на МПБ с добавлением 10 % перфтордекалина, последний извлекали из среды, подвергали автоклавированию в течение 60 мин при 1,0 ати и повторно использовали для выращивания новой культуры в описанных выше условиях (табл. 5).
Таблица 5. Результаты оценки возможности многократного использования перфтордекалина в жидкой питательной среде (МПБ) для культивирования микроорганизмов
Примечания:
1. Использовали перфтордекалин при последовательном выращивании культуры одного штамма; 2. Последовательно использовали перфтордекалин при культивировании E. coli M 17 (2 цикла), P. putida ПП 35 (3 цикла), после каждого цикла отбирали его из культуральной жидкости проводили стерилизацию и использовали его в составе МПБ в следующем цикле культивирования. Контрольные культуры выращивали без применения перфтордекалина. В контроле последовательно выращиваемых культур указаны концентрации клеток, достигаемые на конец культивирования для обеих культур.
Проведенные на псевдомонадах и эшерихиях исследования показали возможность многократного (не менее пяти раз) использования перфтордекалина после извлечения его из культуральной среды и автоклавирования. При этом потери его в каждом цикле культивирования - стерилизации в условиях наших экспериментов не превышали 10%. Более того, результаты экспериментов на примере E. coli M 17 (2 цикла), P. putida ПП 35 (3 цикла) свидетельствовали, что повторное использование перфтордекалина без изменения его активности возможно даже при смене культивируемых микроорганизмов. Практический интерес представляют результаты по выращиванию микромицетов родов Penicillium, Fusarium и Saccharomyces в жидкой питательной среде Чапека-Докса в присутствии перфтордекалина.
В колбы Эрленмейера объемом 250 см3 предварительно вносили посевные культуры соответствующего штамма (до конечной концентрации биомассы указанной на 0 часов культивирования в табл. 6) и перфтордекалин из расчета конечной концентрации 2%, а затем доводили жидкой питательной средой Чапека-Докса общий объем рабочей смеси до 70 см3. Культивирование продолжали в течение 10 суток, каждые 48 часов отбирали пробы по 5 мл для определения биомассы.
Результаты экспериментов представленные в табл. 6 свидетельствуют, что при росте культур микромицетов P. chrysogenum МВ 104, F. moniliforme ВУ 245, F. graminearum 534, S. cerevisiae К на среде Чапека - Докса с добавлением 2% перфтордекалина уже через 48 - 96 часов культивирования было отмечено максимальное содержание количества биомассы, при этом пик концентрации биомассы на среде без перфтордекалина был получен во всех случаях на 48 часов позже. При этом максимальные значения биомассы на среде с перфтордекалином в 1,3 раза (для дрожжей), в 2,0-2,5 раза (для пеницилл и фузариев) превышали максимумы, достигаемые на среде без перфтордекалина.
Таблица 6. Изменение биомассы микромицетов при культивировании в среде Чапека - Докса с добавлением перфтордекалина
Для обеспечения высокого энергетического обмена большинству микроорганизмов, используемых человеком в биотехнологии, для роcта, развития и продукции биологически активных веществ жизненно необходим кислород [1]. Он является важнейшим элементом, используемым микроорганизмами для поcтроения структурных компонентов микробной клетки, получения энергии и непоcредственно участвует в различных биохимических реакциях, обеспечивающих процессы жизнедеятельноcти микробов.
Обеспечение кислородом или его удаление для анаэробов, как и удаление отработанных газов и продуктов метаболизма, является одним из важнейших факторов эффективноcти биотехнологических процессов, определяющих продуктивноcть накопления их биомассы и синтеза биологически активных веществ.
Низкая растворимоcть кислорода в культуральной среде при выращивании микроорганизмов, соcтавляющая всего несколько граммов O2 на м3, не обеспечивает большеобъемный биоcинтез в необходимой степени. Потребноcть микроорганизмов в кислороде может соcтавлять десятки килограммов O2 на кубический метр культуральной среды в час [2].
Целью настоящей работы являлась экспериментальная оценка перспектив использования перфторорганических соединений с газотранспортной функцией в биотехнологии для совершенствования процессов глубинного культивирования практически полезных микроорганизмов.
С учетом этого нами было исследовано влияние на роcт бактерий и микроcкопических грибов (микромицетов) внесения в культуральные среды разных концентраций перфтордекалина или коммерческого препарата <Перфторан> [3, 4].
Из бактериальных культур нами были использованы штаммы Rhodococcus erythropolis ВУ 5 и ВУ 43, Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 81 и ВБМ 158, Escherichia coli M 17, Pseudomonas putida ПП 44, Bacillus subtilis 3; из микромицетов были использованы штаммы Penicillium chrysogenum МВ 104, Fusarium moniliforme ВУ 245, Fusarium graminearum 534, Saccharomyces cerevisiae К. Культуры указанных микроорганизмов были выбраны, потому что в биотехнологии при производстве практически полезных продуктов используется большое количество штаммов этих видов для получения дорогоcтоящих антибиотиков, эубиотиков, микопротеина, пищевых продуктов, стимуляторов роcта растений - гиббереллинов. Псевдомонады и родококки используются в качестве биодеструкторов ксенобиотиков.
Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 158 и ВБМ 81 - штаммы бактерий актиномицетов. Продуценты антибиотика рубомицина, обладают типичными культурально-морфологическими и тинкториальными свойствами, аэробы. Воздушный мицелий развит. Имеются оcобые воздушные гифы (спорофоры) и мицелий, прорастающий в толщу питательной среды. При микроcкопии в мазках, окрашенных по Граму, бактериальные клетки имеют вид тонких длинных ветвящихся нитей, окрашенных грамположительно. На плотной питательной среде колонии красновато-малинового цвета. Колонии имеют неровные края шероховатую поверхноcть с кратерообразным вдавлением в центре. В процессе выращивания на ППС колонии выделяют пигменты, окрашивающие агар соответственно в малиновый цвет в кислой среде и в фиолетовый в щелочной. Оптимальная температура роcта (28-30)оС.
Bacillus subtilis 3 - штамм сенной палочки, культура используется в качестве эубиотика для лечения желудочно-кишечных расстройств у людей. При микроcкопии отмечаются грамположительные палочки с закругленными концами; расположены одиночно, парами или цепочками. Факультативный анаэроб. Разжижает желатину, гидролизует крахмал, казеин, ферментирует глюкозу и мальтозу. Хорошо размножается на пртых питательных средах. На поверхности агара через сутки клоны образуют белесоватые круглые выпуклые колонии с ровными краями.
Escherichia coli M 17 - штамм кишечной палочки, культура используется в качестве эубиотика для лечения желудочно-кишечных расстройств у людей. При микроскопии агаровой культуры данного штамма отмечаются прямые одиночные и парные грамотрицательные палочки. Факультативный анаэроб, оптимум роста отмечается при температуре 35-37оС, хорошо размножается при комнатной температуре на обычных средах. На плотной среде образуют слабовыпуклых полупрозрачных сероватые колонии, в бульоне вызывает диффузное помутнение с образованием осадка.
Rhodococcus erythropolis ВУ 5 и ВУ 43 - штаммы широко распространенных почвенных бактерий, выделены из почвы в Кировской области. При микроскопии окрашенных по Граму мазков отмечаются не образующие спор грамположительные округленные короткие палочковидные и овальные бактерии, при разделении располагаются под углом друг к другу. Клетки в препаратах <раздавленная> и <висячая> капля неподвижные. Оптимальная температура роста (28-32)оС. Аэробы. При росте на плотной среде образуют круглые, выпуклые с ровным краем блестящие слизистые колонии бледно-бежевого цвета.
Pseudomonas putida ПП 44 и ПП 35 - штаммы широко распространенных почвенных бактерий, обладающие типичными характеристиками псевдоманад. Культуры выделены из почвы. При микроскопии окрашенных по Граму мазков отмечаются не образующие спор грамотрицательные палочковидные бактерии с полярно расположенными жгутиками. Бактерии этого вида способны окислять необычайно большое число различных органических соединений, энергию получают путем аэробного дыхания (строгие аэробы), хемоорганотрофы. На плотной среде образуют круглые выпуклые белесоватые с кремовым оттенком колонии с ровным краем. Оптимальная температура роста (28-30)оС.
Penicillium chrysogenum МВ 104 - культура штамма микромицета, выделенного из садовой почвы, обладает типичными для пеницилл культурально-морфологическими и тинкториальными видовыми свойствами, энергию получает путем аэробного дыхания. Морфологически представляет кистевидную плесень, конидиеносец со стеригмами имеет вид кисточки, на концах стеригм цепочки конидий. На агаре Чапека формирует колонии до 30 - 34 мм в диаметре, складчатые, бархатистые, край белый, конидиальная зона зеленая, реверзум лимонного цвета. Оптимальная температура роста (28-30)оС.
Fusarium moniliforme ВУ 245 - микромицет, штамм выделен из кукурузы, обладает типичными культурально-морфологическими и тинкториальными видовыми свойствами, энергию получает путем аэробного дыхания. Макроконидии в воздушном мицелии веретено-серповидные, эллиптически изогнутые, с постепенно суживающейся, несколько удлиненной верхней клеткой, с ясно выраженной ножкой у основания, имеют пять перегородок, микроконидии овальные. На среде Чапека колонии до 34 - 38 мм в диаметре, складчатые, бархатистые, воздушный мицелий бело-розовый, строма розовая. Температура роста (25-28)оС.
Fusarium graminearum 534 - микромицет, штамм выделен из зерновки пшеницы и обладает типичными культурально-морфологическими и тинкториальными видовыми свойствами. Макроконидии в воздушном мицелии веретено-серповидные, эллиптически изогнутые, с постепенно суживающейся, несколько удлиненной верхней клеткой, с ясно выраженной ножкой у основания, имеют три перегородки. На среде Чапека колонии до 32 - 36 мм в диаметре, складчатые, бархатистые, воздушный мицелий бело-розовый, строма кремовая. Температура роста (25-28)оС.
Saccharomyces cerevisiae К - штамм пекарских дрожжей, обладающий типичными культурально-морфологическими и тинкториальными видовыми свойствами, выделен в виде чистой культуры для лабораторных исследований из прессованных дрожжей кировского хлебозавода. При микроскопии отмечаются однородные по морфологии овальные отдельные клетки размером 5-9 мкм, обладающие толстой клеточной стенкой и типичной для эукариот структурой. Культура дрожжей S. cerevisiae 5 сбраживает глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, раффинозу. Хорошо растет на среде Сабуро, Чапека-Докса, агаре Чапека. Факультативный анаэроб. Оптимальная температура роста (28-30)оС.
Для выращивания бактерий и микромицетов использовали мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар и стандартные среды: агар Чапека, среду Чапека-Докса, приготовленные по рекомендованным прописям и технологии [5]. Для выращивания стрептомицетов и фузариозных грибов использовали жидкую питательную среду с соевой мукой, содержащую крахмал - 3,0%; соевую муку - 3,0%; (NH4)2С4Н4О6 - 0,5%; (NH4)2SO4 - 0,4%; CaCO3 - 0,8%; K2HPO4 - 0,01%; глюкозы - 1,5% (вводится в стерильную питательную среду); воды водопроводной до 100%.
В задачу наших исследований входила оценка влияния внесения в среду культивирования пефтордекалина или субмикронной эмульсии <Перфторан> на скорость роста и развития микроорганизмов и прирост биомассы при глубинном культивировании [6, 7]. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 см3 с 80 см3 жидкой питательной среды, содержащей посевные культуры, соответствующего штамма (до конечной концентрации биомассы или концентрации клеток бактерий указанных в табл. 1 - 4 на 0 часов культивирования), и от 0,2 до 25 % перфторана или 0,2 и 2,0 % (по объему) перфтордекалина. Выращивание проводили при (28+2)?С и постоянном шуттелировании со скоростью вращения 230 оборотов в минуту. За ростом актиномицетов наблюдали в течение 11 суток (табл. 1). Через каждые 24 часа отбирали пробы по 5 мл и определяли сухую массу стрептомицетов (в мг%). Контролем во всех экспериментах служили культуры в колбах со средой, отличающейся от опытных сред только отсутствием ПФОС.
Результаты экспериментов, представленные в табл. 1, свидетельствуют, что содержание биомассы стрептомицетов при росте на ферментационной среде на основе соевой муки с добавлением 5% перфторана уже через 72 часа роста по абсолютной величине превышал максимальный прирост биомассы тех же культур, достигаемый на 168 час роста на среде без перфторана, а максимальное содержание биомассы в первой среде для штамма S. purpurogeniscleroticus ВБМ 158, достигаемое на 120 час роста, составляющее 1848 мг%, в 3,7 раза превышало максимальную концентрацию на среде без перфторана.
Таблица 1. Изменение биомассы Streptomyces purpurogeniscleroticus при росте в среде на основе соевой муки с добавлением перфторана
| Штамм Strepto- -myces purpuro- -geniscle- -roticus |
Содержание в среде перфторана, % | Биомасса актиномицетов (мг %) в среде в процессе роста через : ч от начала культивирования | |||||||||||
| 0 | 24 | 48 | 72 | 96 | 120 | 144 | 168 | 192 | 216 | 240 | 264 | ||
| ВБМ - 158 | 0 | 45 | 58 | 154 | 295 | 374 | 398 | 457 | 494 | 441 | 436 | 460 | 387 |
| 0,2 | 45 | 63 | 168 | 346 | 408 | 478 | 583 | 649 | 582 | 577 | 528 | 521 | |
| 1 | 45 | 69 | 184 | 385 | 451 | 857 | 651 | 673 | 589 | 546 | 509 | 502 | |
| 5 | 45 | 95 | 350 | 692 | 1248 | 1848 | 1539 | 1470 | 1305 | 1378 | 1335 | 1196 | |
| 25 | 45 | 96 | 348 | 484 | 743 | 796 | 704 | 663 | 650 | 539 | 492 | 429 | |
| ВБМ - 81 | 0 | 51 | 56 | 142 | 258 | 310 | 342 | 432 | 457 | 438 | 409 | 391 | 365 |
| 0,2 | 51 | 62 | 154 | 307 | 398 | 458 | 503 | 543 | 538 | 530 | 521 | 452 | |
| 1 | 51 | 71 | 177 | 364 | 449 | 619 | 704 | 762 | 693 | 680 | 643 | 563 | |
| 5 | 51 | 90 | 324 | 645 | 1016 | 1316 | 1250 | 1150 | 1028 | 954 | 832 | 708 | |
| 25 | 51 | 92 | 343 | 496 | 895 | 835 | 796 | 745 | 712 | 628 | 621 | 524 | |
Примечание. С целью большей наглядности результатов мы сочли целесообразным в настоящей таблице и в таблицах 2-6 привести только средние арифметические результаты по 4-6 определениям содержания биомассы и концентраций живых бактерий. Во всех случаях степень отклонения единичного определения от средней арифметической не превышала 15%.
Выращивание культур штаммов Pseudomonas putida и Rhodococcus erythropolis проводили в течение 48 часов при (28+2)?С на жидкой питательной среде, на основе соевой муки с добавлением перфторана. Пробы отбирали через каждые 8 часов по 2 мл для определения количества живых клеток псевдомонад и родококков в культуральной среде методом высева серийных разведений на плотную питательную среду на основе МПА (табл.2 и 3).
Таблица 2. Рост культуры бактерий Pseudomonas putida на жидкой питательной среде, на основе соевой муки с добавлением перфторана
| Штамм P. putida | Содержание в среде перфторана, % | Количество живых бактерий/см3 через : ч от начала культивирования, (*106) | ||||||
| 0 | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | ||
| ПП 44 | 0 | 48 | 68 | 348 | 2239 | 6594 | 6703 | 6221 |
| 0,2 | 48 | 75 | 490 | 4563 | 7041 | 7094 | 5342 | |
| 1 | 48 | 104 | 935 | 6563 | 8472 | 8374 | 7125 | |
| 5 | 48 | 178 | 3789 | 28258 | 27533 | 18500 | 14054 | |
| 25 | 48 | 112 | 3645 | 12763 | 9804 | 7071 | 5285 | |
| ПП 35 | 0 | 64 | 75 | 387 | 1338 | 6503 | 8702 | 7669 |
| 0,2 | 64 | 86 | 612 | 2313 | 9044 | 9453 | 7348 | |
| 1 | 64 | 112 | 1158 | 5431 | 11348 | 10986 | 8545 | |
| 5 | 64 | 174 | 5982 | 12995 | 12502 | 10438 | 7659 | |
| 25 | 64 | 132 | 3624 | 7825 | 7024 | 6351 | 4300 | |
Результаты экспериментов, представленные в табл. 2 и 3, свидетельствуют, что при росте на ферментационной среде на основе соевой муки с добавлением 5% перфторана максимальное содержание живых бактерий псевдомонад и родококков достигаемое уже через 24 часа роста по абсолютной величине превышало в 1,5 - 4,2 раза максимальный прирост биомассы тех же культур, зафиксированный на 40 час роста на среде без перфторана. Увеличение содержания перфторана в среде до 25% приводило к снижению достигаемых прироста биомассы S. purpurogeniscleroticus и концентраций клеток P. putida и R. erythropolis в сравнении с аналогичными показателями для среды с 5% перфторана. Аналогичные результаты были получены при росте бактерий на МПБ с перфтордекалином (табл.4). При росте культур бактерий P. putida, R. erythropolis, E. coli и B. subtilis на мясо-пептонном бульоне с добавлением 2% перфтордекалина, уже через 24 часа культивирования было отмечено, максимальное содержание количества живых бактерий в среде, которое в 1,3 - 1,7 раз превышало максимум концентраций живых клеток, достигнутый в среде без перфторана только через 36 часов культивирования.
Следует также отметить, что даже добавление 0,2% перфтордекалина в среду культивирования приводило к ускорению роста исследуемых бактерий в сравнении с контролем, что особенно отчетливо отмечается при выращивании P. putida.
Таблица 3. Рост культуры бактерий Rhodococcus erythropolis на жидкой питательной среде, на основе соевой муки с добавлением перфторана
| Штамм R. erythro-polis | Содержание в среде перфторана, % | Количество живых бактерий/см3 через : ч от начала культивирования, (*106) | ||||||
| 0 | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | ||
| ВУ 5 | 0 | 24 | 26 | 258 | 1485 | 2110 | 2386 | 2105 |
| 0,2 | 24 | 43 | 397 | 1981 | 2304 | 2395 | 2024 | |
| 1 | 24 | 68 | 548 | 4068 | 3706 | 2974 | 2748 | |
| 5 | 24 | 113 | 1569 | 6783 | 4378 | 4307 | 4032 | |
| 25 | 24 | 67 | 1406 | 5434 | 3132 | 2985 | 2210 | |
| ВУ 43 | 0 | 35 | 43 | 198 | 2632 | 3045 | 2945 | 2368 |
| 0,2 | 35 | 51 | 345 | 3268 | 3286 | 3587 | 3152 | |
| 1 | 35 | 73 | 754 | 3670 | 3670 | 3670 | 3670 | |
| 5 | 35 | 124 | 2054 | 9450 | 7541 | 7105 | 5793 | |
| 25 | 35 | 107 | 1526 | 8408 | 6752 | 5054 | 3421 | |
Таблица 4. Рост культур бактерий Pseudomonas putida, Rhodococcus erythropolis, Escherichia coli и Bacillus subtilis на мясо-пептонном бульоне с добавлением перфтордекалина
| Штамм | Содержание в среде перфтордекалина, % | Содержание в среде перфтордекалина, % | ||||
| 0 | 12 | 24 | 36 | 48 | ||
| P. putida ПП 44 | 0 | 49 | 96 | 1899 | 5029 | 4342 |
| 0,2 | 49 | 163 | 6986 | 5732 | 4437 | |
| 2,0 | 49 | 251 | 8475 | 6348 | 4903 | |
| R. erythropolis ВУ 43 | 0 | 42 | 77 | 1087 | 2438 | 2298 |
| 0,2 | 42 | 85 | 1584 | 2953 | 2568 | |
| 2,0 | 42 | 97 | 3948 | 3732 | 2329 | |
| E. coli M 17 | 0 | 45 | 109 | 2436 | 6423 | 5563 |
| 0,2 | 45 | 112 | 2662 | 7484 | 5431 | |
| 2,0 | 45 | 125 | 8425 | 6617 | 5042 | |
| B. subtilis 3 | 0 | 54 | 74 | 985 | 2261 | 2138 |
| 0,2 | 54 | 77 | 1112 | 2532 | 2315 | |
| 2,0 | 54 | 80 | 2933 | 2397 | 2254 | |
На следующем этапе исследований была оценена возможность многократной стерилизации перфтордекалина автоклавированием. В ходе предварительных экспериментов было показано, что однократная стерилизация перфтордекалина при избыточном давлении от 0,5 до 2,0 ати, что соответствовало температурному воздействию 111?С до 134?С с экспозицией - 30 - 90 мин существенно не влияла на его эксплуатационные свойства.
Важным результатом проведенных исследований явилось то, что была показана возможность многократного использования перфтордекалина. С этой целью после каждого цикла культивирования бактерий Pseudomonas putida P. putida ПП 35 и E. coli M 17на МПБ с добавлением 10 % перфтордекалина, последний извлекали из среды, подвергали автоклавированию в течение 60 мин при 1,0 ати и повторно использовали для выращивания новой культуры в описанных выше условиях (табл. 5).
Таблица 5. Результаты оценки возможности многократного использования перфтордекалина в жидкой питательной среде (МПБ) для культивирования микроорганизмов
|
Штаммы бактерий (количество циклов культивирования) |
Концентрация клеток (´107) живых бактерий после выращивания в течение 24 часов в МПБ с 10 % перфтордекалина, использованного и стерилизованного : |
|||||
| контроль |
одно- -кратно |
дву- -кратно |
трех- -кратно |
четырех- -кратно |
пяти- -кратно |
|
|
P. putida ПП 35 |
174 | 862 | 847 | 856 | 864 | 860 |
| E. coli M 17 (пять циклов) | 244 | 811 | 804 | 797 | 808 | 814 |
|
E. coli M 17 (2 цикла)/ P. putida ПП 35 (3 цикла)2 |
242/175 | 815 | 803 | 858 | 869 | 867 |
Примечания:
1. Использовали перфтордекалин при последовательном выращивании культуры одного штамма; 2. Последовательно использовали перфтордекалин при культивировании E. coli M 17 (2 цикла), P. putida ПП 35 (3 цикла), после каждого цикла отбирали его из культуральной жидкости проводили стерилизацию и использовали его в составе МПБ в следующем цикле культивирования. Контрольные культуры выращивали без применения перфтордекалина. В контроле последовательно выращиваемых культур указаны концентрации клеток, достигаемые на конец культивирования для обеих культур.
Проведенные на псевдомонадах и эшерихиях исследования показали возможность многократного (не менее пяти раз) использования перфтордекалина после извлечения его из культуральной среды и автоклавирования. При этом потери его в каждом цикле культивирования - стерилизации в условиях наших экспериментов не превышали 10%. Более того, результаты экспериментов на примере E. coli M 17 (2 цикла), P. putida ПП 35 (3 цикла) свидетельствовали, что повторное использование перфтордекалина без изменения его активности возможно даже при смене культивируемых микроорганизмов. Практический интерес представляют результаты по выращиванию микромицетов родов Penicillium, Fusarium и Saccharomyces в жидкой питательной среде Чапека-Докса в присутствии перфтордекалина.
В колбы Эрленмейера объемом 250 см3 предварительно вносили посевные культуры соответствующего штамма (до конечной концентрации биомассы указанной на 0 часов культивирования в табл. 6) и перфтордекалин из расчета конечной концентрации 2%, а затем доводили жидкой питательной средой Чапека-Докса общий объем рабочей смеси до 70 см3. Культивирование продолжали в течение 10 суток, каждые 48 часов отбирали пробы по 5 мл для определения биомассы.
Результаты экспериментов представленные в табл. 6 свидетельствуют, что при росте культур микромицетов P. chrysogenum МВ 104, F. moniliforme ВУ 245, F. graminearum 534, S. cerevisiae К на среде Чапека - Докса с добавлением 2% перфтордекалина уже через 48 - 96 часов культивирования было отмечено максимальное содержание количества биомассы, при этом пик концентрации биомассы на среде без перфтордекалина был получен во всех случаях на 48 часов позже. При этом максимальные значения биомассы на среде с перфтордекалином в 1,3 раза (для дрожжей), в 2,0-2,5 раза (для пеницилл и фузариев) превышали максимумы, достигаемые на среде без перфтордекалина.
Таблица 6. Изменение биомассы микромицетов при культивировании в среде Чапека - Докса с добавлением перфтордекалина
| Штамм | Содержание в среде перфтордекалина, % | Биомасса микромицетов (мг %) в среде Чапека - Докса в процессе роста через : ч от начала культивирования | |||||
|
0 |
48 |
96 |
144 |
192 |
240 |
||
|
P. chrysogenum МВ 104 |
0 |
36 |
259 |
705 |
816 |
794 |
745 |
|
2,0 |
36 |
682 |
1656 |
1518 |
1356 |
880 |
|
|
F. moniliforme ВУ 245 |
0 |
48 |
272 |
764 |
858 |
803 |
731 |
|
2,0 |
48 |
743 |
2145 |
1652 |
1493 |
976 |
|
|
F. graminearum
534 |
0 |
42 |
264 |
687 |
795 |
783 |
645 |
|
2,0 |
42 |
729 |
1964 |
1421 |
1245 |
927 |
|
|
S. cerevisiae К |
0 | 65 | 440 | 497 | 220 | 204 | 134 |
| |||||||