Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Нефть относится к наиболее интенсивно используемым природным полезным ископаемым. Процессы добычи, транспортировки, переработки нефти и использования нефтепродуктов часто сопровождаются технологическими и аварийными выбросами их во внешнюю среду, что приводит к загрязнению и нарушению экосистем различной интенсивности, вплоть до экологических катастроф. Площади нефтезагрязненных земель и водоемов с каждым годом увеличиваются, поэтому продолжает оставаться актуальной проблема разработки новых и совершенствования существующих технологий ликвидации последствий техногенных контаминаций нефтью и нефтепродуктами и восстановления биопотенциала нарушенных экосистем [1].
Экономический эффект, получаемый в результате реабилитации природного потенциала при очистке от нефтяных загрязнений одного гектара земли, изымающейся из пользования в результате аварийных выбросов нефтепродуктов, составляет несколько десятков тысяч долларов (в зависимости от структуры землепользования, для пахотных земель - 30000 долларов, для пастбищных и сенокосов - 200000 долларов, для промышленных районов - 2335000 долларов) [2].
В последние годы появилось много публикаций об эффективном использовании микроорганизмов для удаления экотоксикантов на основе нефти [2 - 4]. Механизмы микробной биодеструкции нефти и нефтепродуктов самые разнообразные: от биотрансформации под воздействием разнообразных ферментов, до полной утилизации и использования в качестве источника углерода и энергии. С учетом таких способностей микроорганизмов был предложен метод биокоррекции загрязнений, который включает в качестве основных подходов биостимуляцию - активацию деградирующей способности аборигенной микрофлоры почвы или воды, путем внесения биогенных элементов, и биодополнение - интродукцию в загрязненные нефтепродуктами очаги специализированных микроорганизмов.
Основные преимущества микробиологической деструкции перед другими методами заключаются: в более полной степени очистки, экологической безопасности, относительной дешевизне, возможности постоянной обработки "хронических" загрязнений и возможности использования в зонах труднодоступных для выемки грунтов.
Еще недавно предполагалось, что микроорганизмы, способные разлагать и использовать углеводороды нефти и нефтепродуктов, встречаются только там, где расположены нефтепромыслы, нефтехранилища или нефтепроводы, т. е. только там, где имеются источники постоянного загрязнения ими внешней среды. Однако, согласно современным данным, такие микроорганизмы распространены очень широко и могут быть выделены из любой луговой, лесной, полевой почвы [2-4]. Кроме того, способность использовать нефть в качестве источника энергии присуща не только конкретным специализированным формам микробов, а широкому кругу бактерий и микроскопических грибов.
К биодеструкторам нефтепродуктов относят значительное число микроорганизмов представителей разных таксономических групп: псевдомонад, бацилл, родококков, микобактерий, дрожжевых микромицетов и других микробов. Всем этим микроорганизмам при росте на углеводородах нефтепродуктов крайне необходим кислород.
Предельные скорости транспорта кислорода в средах, содержащих высокие концентрации углеводородов, часто остаются недостаточными в отношении микроорганизмов нефтедеструкторов, что существенно ограничивает скорость и степень биодеградации нефти и нефтепродуктов. С учетом этого нами было использовано внесение в среды разных концентраций перфторорганического соединения (ПФОС) с газотранспортной функцией - перфтордекалина. При этом ПФОС нас заинтересовали из-за своей химической устойчивости и большой способности растворять газы. Известно, что они растворяют до 40-50 об. % кислорода и до 150-200 об. % углекислого газа и способны доставлять их клеткам и тканям организма [5].
Цель данной работы заключалась в экспериментальном обосновании перспективности использования перфторорганических соединений с газотранспортной функцией для ускорения процессов биодеградации нефти и выращивания микроорганизмов биодеструкторов на синтетических средах содержащих только воду, соли, а в качестве источника углерода и энергии нефть или нефтепродукты, что позволяет адаптировать биодеструкторы для интродукции в места нефтезагрязнений.
В качестве биодеструкторов нефтепродуктов были использованы выделенные сотрудниками лаборатории микробиологии ВятГУ культуры углеводородокисляющих бактерий родов Pseudomonas, Rodococcus и Bacillus [6]. Характеристика основных культурально-морфологических свойств использованных штаммов представлена в табл. 1.
Таблица 1. Свойства штаммов бактерий биодеструкторов
Для выращивания углеводородокисляющих микроорганизмов, использовали синтетическую минеральную среду следующего состава (г/л): аммоний фосфорнокислый однозамещенный - 9,0; натрий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0; калий фосфорнокислый двузамещенный - 10,0; кальция хлорид - 0,04; магний сернокислый семиводный - 0,7; железо сернокислое семиводное - 0,013; цинк сернокислый семиводный - 0,012; марганец сернокислый семиводный - 0,012; воды водопроводной до 1 дм3, рН среды 6,9+0,1. Навески солей растворяли в воде раздельно и смешивали после стерилизации в асептических условиях, затем доводили рН среды до заданных значений.
В стерильные колбы Эрленмейера емкостью 250 см3 вносили: навески 0,5 г (1 % по массе) нефти или мазута; 0,5 или 2,5 см3 перфтордекалина (1 и 5,0 об.%); культуру одного из микроорганизмов биодеструкторов в объеме 1 см3 с концентрацией 5.109 бактерий/см3 по оптическому стандарту мутности (ОК), а затем готовой синтетической средой доводили общий объем рабочей смеси до 50 см3 (до конечной концентрации в рабочей суспензии 1.108 живых бактерий в 1 см3 по ОК). Одновременно ставили контрольные опыты с колбами, в которых отсутствовал один из исследуемых компонентов: нефтепродукт, культура микроорганизмов или перфтордекалин, а также определяли биологическую концентрацию (количество живых) бактерий в среде путем высева серийных разведений культуры на плотную среду на основе мясопептонного агара.
Колбы помещали на шуттель, выращивание культур вели в течение 4 суток при (29+2)?С и 250 оборотах в минуту. Для сравнения характера роста бактерий при нормальном углеводном питании с культурой Pseudomonas putida ВУ186 был поставлен эксперимент, когда в жидкую синтетическую среду вместо нефтепродуктов добавили стерильный раствор глюкозы до конечного содержания ее в среде 0,5 г (1%).
Количественное определение нефтепродуктов в среде после культивирования проводили гравиметрическим (весовым) методом. Метод достаточно прост, не требует сложного дорогостоящего оборудования. Недостатком метода считается относительно большая погрешность при обнаружении легких фракций углеводородов. Для преодоления этого недостатка, в схему анализа была включена контрольная проба, представляющая собой смесь питательной среды с эквивалентным количеством нефтепродукта и проводимая по режиму опытных проб, но без добавления микробного инокулята. Во время выращивания каждые 24 часа и после окончания процесса отбирали пробы объемом 0,2 мл для определения количества живых бактерий методом серийных разведений с высевом на плотную питательную среду на основе мясопептонного агара.
После завершения процесса выращивания с помощью делительной воронки извлекали перфтордекалин и проводили экстракцию остатков нефтепродуктов хлороформом (25 см3 на весь объем среды) на шуттеле в течение 20 минут и последующей 8:10 часовой экспозицией.
Экстракты, отделяли на делительной воронке, сушили прокаленным сульфатом натрия в течение 30-40 мин., после чего отгоняли растворитель на водяной бане при температуре (75:80)?С. Пары растворителя конденсировали в холодильнике, а сам растворитель собирали в приемник. Полученные остатки после отгонки растворителя помещали в сухожаровой шкаф и при температуре (80:85)?С выпаривали до постоянной массы. Пробы после охлаждения взвешивали с точностью до 0,0001 г и рассчитывали содержание нефтепродуктов. Данные анализа массы остатков нефтепродуктов в опытной и контрольной пробах использовались для расчета степени биологической утилизации (БУ) исследуемой культурой микроорганизмов нефти и мазута по формуле:
БУ = (Мк-Мо)/Мк * 100 % , (1)
где Мк - масса нефтепродукта в исходной (контрольной) пробе (среднее арифметическое параллельных определений);
Мо - масса остатка нефтепродукта в опытной пробе (среднее арифметическое параллельных определений).
Биодеструктивную активность культур оценивали с учетом прироста количества микроорганизмов в культуральной среде и степени биологической утилизации нефтепродуктов (табл. 2-7).
Результаты экспериментов, представленные в табл. 2-7 свидетельствуют, что при отсутствии в синтетической среде углеводородов рост всех культур микроорганизмов отсутствовал, при этом первые 24-48 концентрация микроорганизмов держалась на исходном или близком к нему уровне, а затем наступало интенсивное отмирание бактерий. Внесение в среду нефти или мазута сопровождалось 6-11 кратным увеличением количества бактерий через 72-96 часов культивирования. При этом более интенсивный рост бактерий всех видов отмечался на среде с нефтью.
Таблица 2. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде в отношении нефти
Примечание. С целью большей наглядности результатов мы сочли целесообразным в настоящей таблице и в таблицах 3-8 привести только средние арифметические результаты по 4-6 определениям концентраций живых бактерий и степени утилизации ими нефтепродуктов. Во всех случаях степень отклонения единичного определения от средней арифметической не превышала 15 %.
Таблица 3. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде в отношении мазута
Экономический эффект, получаемый в результате реабилитации природного потенциала при очистке от нефтяных загрязнений одного гектара земли, изымающейся из пользования в результате аварийных выбросов нефтепродуктов, составляет несколько десятков тысяч долларов (в зависимости от структуры землепользования, для пахотных земель - 30000 долларов, для пастбищных и сенокосов - 200000 долларов, для промышленных районов - 2335000 долларов) [2].
В последние годы появилось много публикаций об эффективном использовании микроорганизмов для удаления экотоксикантов на основе нефти [2 - 4]. Механизмы микробной биодеструкции нефти и нефтепродуктов самые разнообразные: от биотрансформации под воздействием разнообразных ферментов, до полной утилизации и использования в качестве источника углерода и энергии. С учетом таких способностей микроорганизмов был предложен метод биокоррекции загрязнений, который включает в качестве основных подходов биостимуляцию - активацию деградирующей способности аборигенной микрофлоры почвы или воды, путем внесения биогенных элементов, и биодополнение - интродукцию в загрязненные нефтепродуктами очаги специализированных микроорганизмов.
Основные преимущества микробиологической деструкции перед другими методами заключаются: в более полной степени очистки, экологической безопасности, относительной дешевизне, возможности постоянной обработки "хронических" загрязнений и возможности использования в зонах труднодоступных для выемки грунтов.
Еще недавно предполагалось, что микроорганизмы, способные разлагать и использовать углеводороды нефти и нефтепродуктов, встречаются только там, где расположены нефтепромыслы, нефтехранилища или нефтепроводы, т. е. только там, где имеются источники постоянного загрязнения ими внешней среды. Однако, согласно современным данным, такие микроорганизмы распространены очень широко и могут быть выделены из любой луговой, лесной, полевой почвы [2-4]. Кроме того, способность использовать нефть в качестве источника энергии присуща не только конкретным специализированным формам микробов, а широкому кругу бактерий и микроскопических грибов.
К биодеструкторам нефтепродуктов относят значительное число микроорганизмов представителей разных таксономических групп: псевдомонад, бацилл, родококков, микобактерий, дрожжевых микромицетов и других микробов. Всем этим микроорганизмам при росте на углеводородах нефтепродуктов крайне необходим кислород.
Предельные скорости транспорта кислорода в средах, содержащих высокие концентрации углеводородов, часто остаются недостаточными в отношении микроорганизмов нефтедеструкторов, что существенно ограничивает скорость и степень биодеградации нефти и нефтепродуктов. С учетом этого нами было использовано внесение в среды разных концентраций перфторорганического соединения (ПФОС) с газотранспортной функцией - перфтордекалина. При этом ПФОС нас заинтересовали из-за своей химической устойчивости и большой способности растворять газы. Известно, что они растворяют до 40-50 об. % кислорода и до 150-200 об. % углекислого газа и способны доставлять их клеткам и тканям организма [5].
Цель данной работы заключалась в экспериментальном обосновании перспективности использования перфторорганических соединений с газотранспортной функцией для ускорения процессов биодеградации нефти и выращивания микроорганизмов биодеструкторов на синтетических средах содержащих только воду, соли, а в качестве источника углерода и энергии нефть или нефтепродукты, что позволяет адаптировать биодеструкторы для интродукции в места нефтезагрязнений.
В качестве биодеструкторов нефтепродуктов были использованы выделенные сотрудниками лаборатории микробиологии ВятГУ культуры углеводородокисляющих бактерий родов Pseudomonas, Rodococcus и Bacillus [6]. Характеристика основных культурально-морфологических свойств использованных штаммов представлена в табл. 1.
Таблица 1. Свойства штаммов бактерий биодеструкторов
|
Штамм |
Характеристика клеток |
Характеристика колоний |
Отношение к кислороду |
|||
|
Форма |
окраска по Граму |
Подвиж?ность |
форма |
цвет |
||
|
Pseudomonas putida ВУ186 |
Палочки с закруглен- |
Г- |
Подвижны |
Круглые, выпуклые, край ровный |
Светло- серый или кремовый |
Аэробы |
|
Rhodococcus erythropolis ВУ 321 |
Палочко- |
Г+ |
Неподвижны |
Круглые, выпуклые, край ровный |
Бледно-бежевые |
Аэробы |
|
Bacillus subtilis ВУ 367 |
Палочки с закруглен- |
Г+ |
Подвижны |
Круглые, выпуклые, край ровный |
Белые или светло серые |
Факульта?тивные анаэробы |
Для выращивания углеводородокисляющих микроорганизмов, использовали синтетическую минеральную среду следующего состава (г/л): аммоний фосфорнокислый однозамещенный - 9,0; натрий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0; калий фосфорнокислый двузамещенный - 10,0; кальция хлорид - 0,04; магний сернокислый семиводный - 0,7; железо сернокислое семиводное - 0,013; цинк сернокислый семиводный - 0,012; марганец сернокислый семиводный - 0,012; воды водопроводной до 1 дм3, рН среды 6,9+0,1. Навески солей растворяли в воде раздельно и смешивали после стерилизации в асептических условиях, затем доводили рН среды до заданных значений.
В стерильные колбы Эрленмейера емкостью 250 см3 вносили: навески 0,5 г (1 % по массе) нефти или мазута; 0,5 или 2,5 см3 перфтордекалина (1 и 5,0 об.%); культуру одного из микроорганизмов биодеструкторов в объеме 1 см3 с концентрацией 5.109 бактерий/см3 по оптическому стандарту мутности (ОК), а затем готовой синтетической средой доводили общий объем рабочей смеси до 50 см3 (до конечной концентрации в рабочей суспензии 1.108 живых бактерий в 1 см3 по ОК). Одновременно ставили контрольные опыты с колбами, в которых отсутствовал один из исследуемых компонентов: нефтепродукт, культура микроорганизмов или перфтордекалин, а также определяли биологическую концентрацию (количество живых) бактерий в среде путем высева серийных разведений культуры на плотную среду на основе мясопептонного агара.
Колбы помещали на шуттель, выращивание культур вели в течение 4 суток при (29+2)?С и 250 оборотах в минуту. Для сравнения характера роста бактерий при нормальном углеводном питании с культурой Pseudomonas putida ВУ186 был поставлен эксперимент, когда в жидкую синтетическую среду вместо нефтепродуктов добавили стерильный раствор глюкозы до конечного содержания ее в среде 0,5 г (1%).
Количественное определение нефтепродуктов в среде после культивирования проводили гравиметрическим (весовым) методом. Метод достаточно прост, не требует сложного дорогостоящего оборудования. Недостатком метода считается относительно большая погрешность при обнаружении легких фракций углеводородов. Для преодоления этого недостатка, в схему анализа была включена контрольная проба, представляющая собой смесь питательной среды с эквивалентным количеством нефтепродукта и проводимая по режиму опытных проб, но без добавления микробного инокулята. Во время выращивания каждые 24 часа и после окончания процесса отбирали пробы объемом 0,2 мл для определения количества живых бактерий методом серийных разведений с высевом на плотную питательную среду на основе мясопептонного агара.
После завершения процесса выращивания с помощью делительной воронки извлекали перфтордекалин и проводили экстракцию остатков нефтепродуктов хлороформом (25 см3 на весь объем среды) на шуттеле в течение 20 минут и последующей 8:10 часовой экспозицией.
Экстракты, отделяли на делительной воронке, сушили прокаленным сульфатом натрия в течение 30-40 мин., после чего отгоняли растворитель на водяной бане при температуре (75:80)?С. Пары растворителя конденсировали в холодильнике, а сам растворитель собирали в приемник. Полученные остатки после отгонки растворителя помещали в сухожаровой шкаф и при температуре (80:85)?С выпаривали до постоянной массы. Пробы после охлаждения взвешивали с точностью до 0,0001 г и рассчитывали содержание нефтепродуктов. Данные анализа массы остатков нефтепродуктов в опытной и контрольной пробах использовались для расчета степени биологической утилизации (БУ) исследуемой культурой микроорганизмов нефти и мазута по формуле:
БУ = (Мк-Мо)/Мк * 100 % , (1)
где Мк - масса нефтепродукта в исходной (контрольной) пробе (среднее арифметическое параллельных определений);
Мо - масса остатка нефтепродукта в опытной пробе (среднее арифметическое параллельных определений).
Биодеструктивную активность культур оценивали с учетом прироста количества микроорганизмов в культуральной среде и степени биологической утилизации нефтепродуктов (табл. 2-7).
Результаты экспериментов, представленные в табл. 2-7 свидетельствуют, что при отсутствии в синтетической среде углеводородов рост всех культур микроорганизмов отсутствовал, при этом первые 24-48 концентрация микроорганизмов держалась на исходном или близком к нему уровне, а затем наступало интенсивное отмирание бактерий. Внесение в среду нефти или мазута сопровождалось 6-11 кратным увеличением количества бактерий через 72-96 часов культивирования. При этом более интенсивный рост бактерий всех видов отмечался на среде с нефтью.
Таблица 2. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде в отношении нефти
|
Концентра-ция перфтордекалина, % |
Концентра-ция нефти, % |
Исходная концентра-ция живых микробов в см3 ´108 |
Концентрация живых бактерий в см3 в среде после:ч роста на синтетической среде, ´108 |
Степень утилизации нефти, % |
||||
|
24 |
48 |
72 |
96 |
|
|
|||
|
0 |
0 |
0,9 |
0,8 |
0,8 |
0,6 |
0,5 |
- |
|
|
1 |
0,9 |
1,8 |
5,4 |
10,2 |
9,6 |
8,6 |
|
|
|
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
|
|
1 |
0 |
0,9 |
1,0 |
1,1 |
0,8 |
0,5 |
- |
|
|
1 |
0,9 |
7,7 |
33,5 |
55,4 |
47,6 |
64,5 |
|
|
|
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
|
|
5 |
0 |
0,9 |
1,1 |
1,2 |
0,7 |
0,3 |
- |
|
|
1 |
0,9 |
9,6 |
47,2 |
56,3 |
42,7 |
94,2 |
|
|
|
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
|
Примечание. С целью большей наглядности результатов мы сочли целесообразным в настоящей таблице и в таблицах 3-8 привести только средние арифметические результаты по 4-6 определениям концентраций живых бактерий и степени утилизации ими нефтепродуктов. Во всех случаях степень отклонения единичного определения от средней арифметической не превышала 15 %.
Таблица 3. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде в отношении мазута
|
Концентра-ция перфтор-декалина, % |
Концентра-ция мазута, % |
Исходная концентра-ция живых микробов в см3 ´108 |
Концентрация живых бактерий в см3 в среде после:ч роста на синтетической среде, ´108 |
Степень утилиза-ции мазута, % |
||||
|
24 |
48 |
72 |
96 |
|
||||
|
0 |
0 |
0,9 |
0,8 |
0,7 |
0,6 |
0,5 |
- |
|
|
1 |
0,9 |
1,5 |
3,9 |
8,2 |
8,0 |
5,8 |
|
|
|
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
|
|
1 |
0 |
0,9 |
1,0 |
1,0 |
0,7 |
0,5 |
- |
|
|
1 |
0,9 |
6,2 |
17,3 |
36,8 |
40,3 |
39,7 |
|
|
|
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
|
|
5 |
0 |
0,9 |
1,1 |
1,1 |
Список литературы 1. Использование биогенных добавок совместно с препаратом <Деворойл> для рекультивации нефтезагрязненных почв / Габбасова И.М., Сулейманов Р.Р., Бойко Т.Ф. и др. // Биотехнология. - 2002.- ?2. - С. 57 - 65. 2. Эффективные микроорганизмы-нефтедеструкторы для биологической рекультивации почв / Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Артемова С.А. и др.// Тез. докл. 1-го Международного Конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 14-18 октября 2002 г.). - М.:ЗАО Максима>, РХТУ им Д. И. Менделеева, 2002. - С.294. 3. Киреева Н.А. // Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. Уфа, 1994. - 171 с. 4. Интенсификация процессов очистки воды и почвы от нефтянных загрязнений в присутствии переносчиков кислорода / Курашов В. М., Емельянов В. М., Сахно Т. В. и др. // Тез. докл. 1-го Международного Конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 14-18 октября 2002 г.). - М.:ЗАО Максима>, РХТУ им Д. И. Менделеева, 2002. - С. 293 -294. 5. Иваницкий Г. Р. Биофизические основы создания перфторуглеродных сред и газотранспортных кровезаменителей (обзор) //Сборник научных трудов НПФ <Перфторан>: Перфторорганические соединения в биологии и медицине. - Пущино: ПНЦ РАН, 2001. Вып. XI. - С. 4-48. 6. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Алпашкин Р. И. и др. Выделение и изучение прикладных свойств микроорганизмовнефтедеструкторов//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. <Наука-производство-технологии-экология>, Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.?3. С. 78-79. 7. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Золотарев А. Г., Кривошеина Н. А. Нужна ли <голубая кровь микроорганизмам>?// МВФ. Медицина. Фармация, 2003, ? 2. - С. 7-11. 8. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Кривошеина Н. А. и др. Использование перфторуглеродов для интенсификации процессов микробной деградации нефти и нефтепродуктов//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. <Наука-производство-технологии-экология>, Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.?3. С. 80-81. 9. Бакулин М. К., Пименов Е. В., Дармов И. В. Зачем микроорганизмам <голубая кровь>//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. <Наука-производство-технологии-экология>, Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.?3. - С. 82-83. | |||
| ||||||||