Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Несмотря на некоторое снижение в последние годы абсолютного числа отравлений карбофосом, их актуальность не уменьшается. Это связано с сохраняющейся высокой летальностью, которая достигает 33%. В настоящее время отмечается определенная тенденция к увеличению летальности в соматогенную фазу интоксикации. Это связано в первую очередь с тем, что достигнуты несомненные успехи в изучении специфических механизмов токсического действия карбофоса, способов диагностики, антидотной и детоксикационной терапии в токсикогенную фазу вызываемых им отравлений. Однако, роль неспецифических механизмов, в частности, нарушение равновесия между процессами свободнорадикального окисления и антиоксидантной активности изучена недостаточно.
Отсутствуют данные о влиянии антиоксидантов, включенных в программу лечения острых отравлений карбофосом в соматогенном периоде, на течение интоксикации и скорости восстановления функционального состояния [6].
Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явилось изучение возможности применения комплекса антиоксидантов, состоящего из пяти компонентов (АОК-5) в качестве средства ранней реабилитации после острых отравлений карбофосом средней степени тяжести.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальные исследования выполнены на 60 белых беспородных крысах-самках массой 150-180 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария по 10 особей в клетке. Рацион крыс состоял из стандартного гранулированного корма, который они получали 1 раз в сутки. За 24 часа до эксперимента кормление животных, находившихся на свободном водном режиме, прекращали.
Расчет ЛД50 производился с использованием экспресс метода по В.Б. Прозоровскому [5]. ЛД50 при пероральном введении карбофоса составляло 256,4+/-8,7мг/кг. Моделирование отравления карбофосом средней степени тяжести осуществлялось путем однократного внутрижелудочного введения токсиканта в дозе 2/3 ЛД50.
В состав антиоксидантного комплекса (АОК-5) входили: витамин Е - 20 мг/кг, витамин А - 7 мг/кг, селенит натрия - 0,1 мг/кг вводимые внутрижелудочно, а также витамин С - 20 мг/кг и унитиол - 50 мг/кг вводимые интраперитонеально [4]. Экспериментальную терапию начинали через 2 часа после введения ксенобиотика и продолжали в течение первых трех суток, контрольной группе вводилось плацебо в виде 0,9% раствора NaCl.
Толерантность к физической нагрузке оценивалась при помощи методики учета работы, выполненной животным при беге на третбане. Перед началом эксперимента был проведен отбор животных с исключением агрессивных, остальные были подвергнуты предварительной тренировке на протяжении 3-х дней. Критерием наступления утомления являлся момент, когда животное отказывалось продолжать бег, несмотря на электрическое раздражение [1]. За сутки до введения токсиканта регистрировались фоновые значения и последующая динамика показателя физической работоспособности на 1-е, 3-и, и 5-е сутки, выражаемая в процентах от исходных значений.
Для оценки состояния условно-рефлекторной деятельности (УРД) у животных в каждой группе вырабатывался условный рефлекс активного избегания плаванием [4], заключавшийся в воспитании у крыс навыка выхода из воды на "сушу" и контроль времени латентного периода до затравки, а так же на 1-е, 3-и, и 5-е сутки после введения ксенобиотика.
Определение показателей свободнорадикального окисления и активности антиоксидантной системы проводилось с использованием метода регистрации интенсивности индуцированной биохемилюминисценции, позволяющего, с одной стороны, оценивать интенсивность генерации продуктов ПОЛ, общую активность радикальных окислительных процессов и антиокислительную активность биосубстратов, а с другой стороны - при необходимости узкоспециализированно вычленять отдельные звенья изучаемых систем.
Метод индуцирования биохемилюминесценции гидроперекисью третичного бутила или перекисью водорода с сульфатом железа основан на каталитическом разложении перекиси ионами металла с переходной валентностью - двухвалентным железом и образовании при этом свободных радикалов в результате реакции Фентона [3]. Таким образом, интенсивность свободнорадикального процесса можно определить по сумме энергии, выделяющейся в виде света в ходе реакции в течение минуты и более после инициации процесса. На интенсивность реакции оказывает влияние комплекс соединений, обладающих про- и антиоксидантной активностью, содержащихся в сыворотке крови.
Определение индуцированной биохемилюминисценции в плазме крови проводили c помощью биохемилюминометра БХЛ-06 (Россия), используя модельную систему - 2 % раствор перекиси водорода и 0,05 mM раствор сульфата железа.
Морфологическое исследование: Забор материала для гистологического исследования выполняли после макроскопического описания состояния органов; фиксацию образцов ткани проводили 12% раствором нейтрального формалина и жидкостью Карнуа. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином, по Маллори, по Нисселю толлуидиновым синим, по Ван-Гизон и по Эйнарсону [7]. Проводилось комплексное морфологическое и гистохимическое исследование тканей головного мозга животных. Содержание продуктов гистохимических реакций оценивали по поглощению светового потока на фотомикроскопе "Оптон-3" с приставкой "ФМЭЛ-1" и цифропечатью.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Пероральное введение карбофоса в дозе 2/3 ЛД50 вызывало проявление интоксикации, интерпретируемое нами, как отравление средней степени тяжести. У животных уменьшалась двигательная активность, они принимали сидячее положение, отмечалась саливация, вялая реакция на пищевой раздражитель, учащение дефекации с появлением стула жидкой консистенции, однако сохранялась целенаправленная реакция на болевой раздражитель и стволовые рефлексы. Через сутки после введения токсиканта отмечался регресс вышеописанной симптоматики. При оценке состояния условно-рефлекторной деятельности и показателей толерантности животных к физической нагрузке выявлена следующая динамика: через сутки после введения токсиканта наблюдалось достоверное увеличение времени латентного периода выхода из воды в 5 раз по сравнению с фоновыми показателями. Нормализация зафиксирована к исходу 5-х суток эксперимента (рисунок 2), наряду с этим толерантность к физической нагрузке через сутки от начала интоксикации была ниже исходных значений в 3 раза. По прошествии 3-х суток сохранялось снижение работоспособности и даже спустя 5 суток толерантность к физической нагрузке была значимо ниже исходного значения в 1,2 раза.
Динамика лабораторных параметров оксидативного стресса проявлялась активацией процессов свободнорадикального окисления (СРО) и снижением антиоксидантной активности (АОА) через сутки после начала интоксикации с дальнейшим нарастанием процесса к 3-м суткам от момента затравки. К исходу 5-х суток эксперимента сохранялась повышенная прооксидантная активность по сравнению с фоновыми показателями, а уровень АОА соответствовал исходным значениям (рисунок 1).
Выявленные нарушения функционального состояния сопровождались повышением интенсивности свободнорадикальных процессов и снижением антиоксидантной активности, что свидетельствует о целесообразности фармакологической коррекции оксидативного стресса.
Симптоматика отравлений карбофосом в дозе 2/3 ЛД50 в группе животных с лечением АОК-5 была идентичной таковой в группе без лечения.
При исследовании УРД через сутки от начала интоксикации наблюдалось увеличение времени латентного периода рефлекса в 4 раза. К исходу 5-х суток, как и в контрольной группе зарегистрирована нормализация показателей УРД (рисунок 3). Параллельно с изменением показателей ЦНС через сутки после отравления отмечалось снижение толерантности к физической нагрузке в 2,1 раза по сравнению с исходными значениями. Восстановление физической работоспособности зарегистрировано к исходу 5-х суток эксперимента, в то время как в контрольной группе этот показатель был значимо ниже исходного (рисунок 3).
Динамика показателей оксидативного стресса свидетельствовала об активации процессов свободнорадикального окисления и снижении антиоксидантной активности через 2-е суток после отравления. На фоне применения 5-ти компонентного антиоксидантного комплекса отмечалось достоверное снижение интенсивности СРО и повышение АОА к 3-м суткам после отравления. На 5-й день эксперимента зарегистрирован подъем прооксидантной активности по сравнению с 3-и сутками, что, вероятно, объясняется прекращением введения антиоксидантов (рисунок 1).
В результате статистического анализа была выявлена достоверная корреляционная обратная связь между уровнем СРО и показателем толерантности к физической нагрузке.
Положительный эффект применения антиоксидантов в лечении отравлений карбофосом был подтверждeн результатами сравнительного морфологического исследования. При применении АОК-5 уже через 2 часа после введения гипераргирофильные нейроны с варикозно измененными отростками выявлялись в значительно меньшем количестве, а кариопикноз и разрушение ядра выявлялись, в среднем, в 10 раз реже, чем у животных контрольной группы. В последующие сроки наблюдения повреждение структурных элементов ЦНС носило менее выраженный характер и развивалось более низкими темпами. У всех клеток сохранялись, как минимум, инициальные дендриты, в большинстве же случаев, дендритные разветвления аргирофильных и варикозно измененных отростков были сохранены, в отличие от состояния нейроцитов животных без лечения, клетки которых были округлыми, резко аргирофильными, сморщенными и полностью лишенными отростков.
У животных, получавших АОК-5, при отравлении карбофосом средней степени тяжести наблюдался более ранний регресс симптоматики интоксикации, чем нормализация показателей УРД и физической работоспособности животных. При коррекции оксидативного стресса АОК-5 отмечалось улучшение функционального состояния организма животных, регистрируемое на основании проведенных методик исследования физической работоспособности и функционального состояния ЦНС, коррелируемое с уровнем оксидативного стресса.
Список литературы
1. Бобков Ю.Г., Виноградов В.М., Катков В.Ф. // Фармакологическая коррекция утомления. - М.: Медицина, 1994.-208с.
2. Плужников Н.Н., Магира В.Ф. Легеза В.И., Сосюкин А.Е. Экспериментальная оценка противолучевой активности антиоксидантов в условиях их комплексного применения // Матер. Российской науч. конф. "Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности", 11-12 октября 2001 г. - СПб.: ВМедА, 2001. - С. 409-410.
3. Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К. Применение индуцированной хемилюминесценции для оценки свободно-радикальных реакций в биологических субстратах. / Межвузовский сборник: Биохимия и биофизика микроорганизмов. - Горький, 1983.- С.179-183.
4. Буреш Я., Бурешова О. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения // пер. с англ.- М.: Высшая школа, 1990.- 378с.
5. Прозоровский В.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.М. Экспресс-метод определения средней эффективности дозы и ее ошибки // Фармакология и токсикология, 1978,- с.497-502
6. Аксенов И.В. Применение актопротекторов в комплексном лечении острых экзогенных отравлений карбофосом, дихлорэтаном и этиленгликолем: Автореф. дис. : канд. мед. наук.- СПб., 1996.- 24с.
7. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия // пер. с англ.- М.: Мир:, 1969. - 645 с.
The white breedless rats have been investigated in conditional reflex activity restoration dynamics, exercise tolerance and prominence of oxidative stress after having received malation in the doze of 2/3 LD50 and effectiveness of 5-component antioxidant complex use, i.e. (AOK-5): vitamin E in the doze 20 mg/kg, unityol - 50 mg/kg, vitamin C - 20 mg/kg, vitamin A - 7 mg/kg, natrium celinitus - 0,1 mg/kg administered in the first three days after acute poisoning.
One day before administration the background values and the following dynamics of indexes on the first, third and fifth days were recorded.
Result: Tolerance exercise has been much higher in the group of animals receiving the antioxidant complex during the whole period of observation, but the prominence of oxidative stress has been lower than in the group of animals receiving no treatment.
Conclusion: The use of the AOK-5 has resulted in the improvement of the functional condition of animals, correlated with the level of oxidative stress change indexes.
