Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
1. ВВЕДЕНИЕ.
Санация очагов неспецифического воспаления, сопровождающихся эндогенной интоксикацией и вторичным иммунодефицитом, остается одной из актуальных проблем клинической хирургии, урологии, гинекологии и реаниматологии (Костюченко А.Л., Бельских А.Н., Тулупов А.Н., 2000)
В этой связи чрезвычайно важным представляется проведение комплекса лечебных мероприятий, обеспечивающих адекватную антимикробную терапию и устранение эндогенной интоксикации, что может играть решающую роль в течении заболевания и его исходе.
Из существующих на современном этапе методов антибактериальной терапии очагов неспецифического воспаления общепризнанными считают внутримышечный, внутривенный, внутриартериальный и эндолимфатический путь введения (Страчунский Л.С., Белоусов Ю.Б., Козлов С.Н, 2000, Кузин В.Б., Борисов В.И., Прозорова В.К., Шалунов А.А, 2002). В настоящее время обсуждается возможность введения антибактериальных химиопрепаратов на цитовзвеси (Лохвицкий В.Д., 1999 г), метод "антимикробного удара" (Бельских А.Н. и соавт., 1989).
Однако, при внутримышечном и внутривенном пути введения возможности препарата ограничиваются такими характеристиками, как период полувыведения, максимальная терапевтическая и суточная доза, а также степень связывания с белками плазмы крови.
Поэтому нами была исследована методика введения антибактериальных препаратов на собственных клетках крови пациентов, впервые описанная у больных с очагами неспецифического воспаления в легких (Швецов В.Д., 1991) и в мягких тканях при диабетической микроангиопатии (Лохвицкий В.Д., 1999).
При введении антибиотика на цитовзвеси существенно уменьшается терапевтическая доза препарата, за счет его направленной концентрации в очаге воспаления. Методика, предложенная авторами, заключается в том, что у пациента забирается небольшое количество крови (от 50 до 450 мл), которое фракционируется (плазма отделяется). После этого в оставшуюся клеточную взвесь добавляется разовая доза антибактериального препарата. После этого цитовзвесь возвращают пациенту внутривенно капельно. Мы модифицировали эту методику с целью повышения ее эффективности путем предварительного воздействия на цитовзвесь излучением гелий-неонового лазера в терапевтической дозировке.
Основным носителем антибактериального препарата при данных условиях являются лейкоциты пациента, содержащиеся в полученной цитовзвеси. Эти клетки благодаря своим возможностям по адсорбции и захвату веществ, находящихся в окружающей их жидкости, накапливают добавленный в нее антибактериальный химиопрепарат. Далее по хемотаксису они перемещаются в очаг неспецифического воспаления, где освобождают вещество и способствуют его накоплению и концентрации. Эффективность процесса захвата антибактериального химиопрепарата после предварительной обработки цитовзвеси излучением гелий-неонового лазера увеличивается.
Однако, до сих пор не установлено, сохраняют ли лейкоциты свои хемотаксические свойства при высокой концентрации антибиотика, возникающей вследствие ограниченного объема распределения в объеме полученной цитовзвеси.
2. Цель исследования.
Сравнительный анализ миграционной активности нейтрофильных гранулоцитов пациентов с очагами неспецифического воспаления после их взаимодействия с антибактериальным химиопрепаратом без оптического воздействия и после предварительной обработки излучением гелий-неонового лазера.
3. Материал и методы исследования.
Материалом для исследования служили образцы цельной крови 10 пациентов, находившихся на лечении по поводу распространенного фурункулеза.
Для исследования забирали кровь самотеком в силиконизированную пробирку с гепарином объемом 18 мл. При среднем содержании лейкоцитов в крови пациентов (8,9+/-1,24) *109/л, в полученных образцах в среднем содержалось по (0,16+/-0,07)*109 лейкоцитов. С целью устранения влияния белков плазмы кровь центрифугировали, надосадочную жидкость снимали, цитовзвесь разбавляли физиологическим раствором NaCl до прежнего объема.
После чего каждую пробу делили на три части по 6 мл и помещали в отдельные стеклянные чашки Петри. В две чашки добавляли по 0,3 мл 30% раствора линкомицина, одну из которых облучали светом гелий-неонового лазера (аппарат "Тулон", мощность излучения на торце световода 3 мВт, экспозиция в режиме перемешивания 3 мин). Третья чашка не содержала антибактериальный препарат и не подвергалась облучению лазером. В качестве контроля использовали образцы крови здоровых доноров.
Далее пробы собирали в силиконизированные центрифужные пробирки и добавляли по 2 мл реагента Lympholyte-H (Cedarlane, Канада), перемешивали и отстаивали в течение 40 мин в термостате при 37?С. По окончании термостатирования снимали слой плазмы с лейкоцитами, центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин, далее осадок лейкоцитов освобождали от примеси эритроцитов лизированием в дистиллированной Н2О в течении 40 сек. с последующим добавлением равного по объeму гипертонического (1,8%) раствора NaCl. Лейкоциты повторно центрифугировали и полученный осадок использовали для проведения агарозного теста миграции нейтрофильных гранулоцитов. В качестве индуктора миграции использовался хемотаксический пептид N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) (Sigma, США) в концентрации 10-8 М. Результаты исследования выражали индексом миграции (ИМ), рассчитываемом как длина пробега нейтрофильных гранулоцитов к хемотаксическому пептиду (fMLF) - А, делeнная на длину пробега нейтрофильных гранулоцитов в направлении культуральной среды без fMLF - В. Результаты и их обсуждение. Было установлено, что у пациентов с распространенным фурункулезом происходит снижение индекса миграции нейтрофильных гранулоцитов относительно показателей ИМ здоровых доноров.
Рисунок 1. Сравнительная характеристика ИМ нейтрофильных гранулоцитов пациентов относительно ИМ образцов здоровых доноров.
Установлено, что индекс миграции нейтрофильных гранулоцитов у пациентов с распространенным фурункулезом ниже ИМ образцов крови здоровых доноров. Достоверная разница индекса миграции исследуемых групп образцов крови пациентов отсутствует.
Рисунок 2. Нормальная миграция лейкоцитов донора
Рисунок демонстрирует получение расчетных величин индекса миграции по фотографии микроскопического изображения: ИМ = А/В.
Рисунок 3. Миграция нейтрофильных гранулоцитов пациента с распространенным фурункулезом
Рисунок 4. Миграция нейтрофильных гранулоцитов после добавления линкомицина гидрохлорида 30%
Рисунок 5. Миграция аутолейкоцитов, облученных светом гелий-неонового лазера, после добавления линкомицина гидрохлорида 30% в количестве 0,3 мл
Рисунки 2 и 3 наглядно демонстрируют отсутствие достоверной разницы между миграцией нейтрофильных гранулоцитов пациентов после взаимодействия с антибактериальным химиопрепаратом и оптическим излучением гелий-неонового лазера. Для сравнения приводим изображение подавленной миграции нейтрофильных гранулоцитов, которая была достигнута путем воздействия на клетки цитостатического химипрепарата Dacarbasin medac (Shering AG) в количестве 100 мг препарата на (9,9+/-0,98)*109 лейкоцитов.
Рисунок 6. Подавленная миграция аутолейкоцитов
Как видно из рисунка 6 миграция нейтрофильных гранулоцитов из лунки отсутствует, индекс миграции равен нулю.
Таким образом, впервые была изучена миграционная активность нейтрофильных гранулоцитов пациентов с распространенным фурункулезом, инкубированных с антибиотиком ex vivo. Выявлено отсутствие влияния антибиотика и оптического воздействия излучения гелий-неонового лазера на миграционную активность нейтрофильных гранулоцитов. Полученные данные подтверждают, что нейтрофильные гранулоциты, нагруженные антибиотиком в ходе операции направленного транспорта, способны к передвижению хемотаксическим к очагу неспецифического воспаления.
3. ВЫВОДЫ.
1. Антибактериальный химиопрепарат, добавленный в цитовзвесь, как в присутствии излучения гелий-неонового лазера, так и без него, не влияет на миграционную способность лейкоцитов.
2. Аутолейкоциты пациентов с очагами неспецифического воспаления являются оптимальными "контейнерами" для транспортировки антибактериальных препаратов к очагу неспецифического воспаления.
Список литературы
1) Бельских А.Н., Потапчук В.Б. Совместное применение антибиотиков и экстракорпоральных методов детоксикации в гнойно-септической хирургии // Сб. трудов 9-го ежегодного Санкт-Петербургского нефрологического семинара. - СПб., ТНА, 2001
2) Ержанов О.Н., Швецов Д.А., Даниярова Б.А. Введение антибиотиков в клеточной взвеси крови при плазмаферезе в лечении острых абсцессов лeгких, осложнeнных пиопневмотораксом. // Тр. 3-го Рос. нац. конгресса "Человек и лекарство" - М., 1996. - С. 116.
3) Кузин В.Б., Борисов В.И., Прозорова В.К., Шалунов А.А. Введение в теорию фармакотерапии. Нижний Новгород, Издательство НГМА, 2002 г
4) Костюченко А.Л.,Бельских А.Н., Тулупов А.Н. // Интенсивная терапия послеоперационной раневой инфекции и сепсиса. - СПб.: Фолиант, 2000.
5) Лохвицкий С.В., Ержанова Ш.А., Балаболкин М.И., Сарафанова И.М. Направленный транспорт антибиотиков при лечении больных диабетической гнойной остеоартропатией // Сахарный диабет. - 1999. - ?3 (4).
6) Страчунский Л.С., Белоусов Ю.Б., Козлов С.Н. Антибактериальная терапия (практическое руководство), Москва, 2000 г
Санация очагов неспецифического воспаления, сопровождающихся эндогенной интоксикацией и вторичным иммунодефицитом, остается одной из актуальных проблем клинической хирургии, урологии, гинекологии и реаниматологии (Костюченко А.Л., Бельских А.Н., Тулупов А.Н., 2000)
В этой связи чрезвычайно важным представляется проведение комплекса лечебных мероприятий, обеспечивающих адекватную антимикробную терапию и устранение эндогенной интоксикации, что может играть решающую роль в течении заболевания и его исходе.
Из существующих на современном этапе методов антибактериальной терапии очагов неспецифического воспаления общепризнанными считают внутримышечный, внутривенный, внутриартериальный и эндолимфатический путь введения (Страчунский Л.С., Белоусов Ю.Б., Козлов С.Н, 2000, Кузин В.Б., Борисов В.И., Прозорова В.К., Шалунов А.А, 2002). В настоящее время обсуждается возможность введения антибактериальных химиопрепаратов на цитовзвеси (Лохвицкий В.Д., 1999 г), метод "антимикробного удара" (Бельских А.Н. и соавт., 1989).
Однако, при внутримышечном и внутривенном пути введения возможности препарата ограничиваются такими характеристиками, как период полувыведения, максимальная терапевтическая и суточная доза, а также степень связывания с белками плазмы крови.
Поэтому нами была исследована методика введения антибактериальных препаратов на собственных клетках крови пациентов, впервые описанная у больных с очагами неспецифического воспаления в легких (Швецов В.Д., 1991) и в мягких тканях при диабетической микроангиопатии (Лохвицкий В.Д., 1999).
При введении антибиотика на цитовзвеси существенно уменьшается терапевтическая доза препарата, за счет его направленной концентрации в очаге воспаления. Методика, предложенная авторами, заключается в том, что у пациента забирается небольшое количество крови (от 50 до 450 мл), которое фракционируется (плазма отделяется). После этого в оставшуюся клеточную взвесь добавляется разовая доза антибактериального препарата. После этого цитовзвесь возвращают пациенту внутривенно капельно. Мы модифицировали эту методику с целью повышения ее эффективности путем предварительного воздействия на цитовзвесь излучением гелий-неонового лазера в терапевтической дозировке.
Основным носителем антибактериального препарата при данных условиях являются лейкоциты пациента, содержащиеся в полученной цитовзвеси. Эти клетки благодаря своим возможностям по адсорбции и захвату веществ, находящихся в окружающей их жидкости, накапливают добавленный в нее антибактериальный химиопрепарат. Далее по хемотаксису они перемещаются в очаг неспецифического воспаления, где освобождают вещество и способствуют его накоплению и концентрации. Эффективность процесса захвата антибактериального химиопрепарата после предварительной обработки цитовзвеси излучением гелий-неонового лазера увеличивается.
Однако, до сих пор не установлено, сохраняют ли лейкоциты свои хемотаксические свойства при высокой концентрации антибиотика, возникающей вследствие ограниченного объема распределения в объеме полученной цитовзвеси.
2. Цель исследования.
Сравнительный анализ миграционной активности нейтрофильных гранулоцитов пациентов с очагами неспецифического воспаления после их взаимодействия с антибактериальным химиопрепаратом без оптического воздействия и после предварительной обработки излучением гелий-неонового лазера.
3. Материал и методы исследования.
Материалом для исследования служили образцы цельной крови 10 пациентов, находившихся на лечении по поводу распространенного фурункулеза.
Для исследования забирали кровь самотеком в силиконизированную пробирку с гепарином объемом 18 мл. При среднем содержании лейкоцитов в крови пациентов (8,9+/-1,24) *109/л, в полученных образцах в среднем содержалось по (0,16+/-0,07)*109 лейкоцитов. С целью устранения влияния белков плазмы кровь центрифугировали, надосадочную жидкость снимали, цитовзвесь разбавляли физиологическим раствором NaCl до прежнего объема.
После чего каждую пробу делили на три части по 6 мл и помещали в отдельные стеклянные чашки Петри. В две чашки добавляли по 0,3 мл 30% раствора линкомицина, одну из которых облучали светом гелий-неонового лазера (аппарат "Тулон", мощность излучения на торце световода 3 мВт, экспозиция в режиме перемешивания 3 мин). Третья чашка не содержала антибактериальный препарат и не подвергалась облучению лазером. В качестве контроля использовали образцы крови здоровых доноров.
Далее пробы собирали в силиконизированные центрифужные пробирки и добавляли по 2 мл реагента Lympholyte-H (Cedarlane, Канада), перемешивали и отстаивали в течение 40 мин в термостате при 37?С. По окончании термостатирования снимали слой плазмы с лейкоцитами, центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин, далее осадок лейкоцитов освобождали от примеси эритроцитов лизированием в дистиллированной Н2О в течении 40 сек. с последующим добавлением равного по объeму гипертонического (1,8%) раствора NaCl. Лейкоциты повторно центрифугировали и полученный осадок использовали для проведения агарозного теста миграции нейтрофильных гранулоцитов. В качестве индуктора миграции использовался хемотаксический пептид N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) (Sigma, США) в концентрации 10-8 М. Результаты исследования выражали индексом миграции (ИМ), рассчитываемом как длина пробега нейтрофильных гранулоцитов к хемотаксическому пептиду (fMLF) - А, делeнная на длину пробега нейтрофильных гранулоцитов в направлении культуральной среды без fMLF - В. Результаты и их обсуждение. Было установлено, что у пациентов с распространенным фурункулезом происходит снижение индекса миграции нейтрофильных гранулоцитов относительно показателей ИМ здоровых доноров.
Рисунок 1. Сравнительная характеристика ИМ нейтрофильных гранулоцитов пациентов относительно ИМ образцов здоровых доноров.
Установлено, что индекс миграции нейтрофильных гранулоцитов у пациентов с распространенным фурункулезом ниже ИМ образцов крови здоровых доноров. Достоверная разница индекса миграции исследуемых групп образцов крови пациентов отсутствует.
Рисунок 2. Нормальная миграция лейкоцитов донора
Рисунок демонстрирует получение расчетных величин индекса миграции по фотографии микроскопического изображения: ИМ = А/В.
Рисунок 3. Миграция нейтрофильных гранулоцитов пациента с распространенным фурункулезом
Рисунок 4. Миграция нейтрофильных гранулоцитов после добавления линкомицина гидрохлорида 30%
Рисунок 5. Миграция аутолейкоцитов, облученных светом гелий-неонового лазера, после добавления линкомицина гидрохлорида 30% в количестве 0,3 мл
Рисунки 2 и 3 наглядно демонстрируют отсутствие достоверной разницы между миграцией нейтрофильных гранулоцитов пациентов после взаимодействия с антибактериальным химиопрепаратом и оптическим излучением гелий-неонового лазера. Для сравнения приводим изображение подавленной миграции нейтрофильных гранулоцитов, которая была достигнута путем воздействия на клетки цитостатического химипрепарата Dacarbasin medac (Shering AG) в количестве 100 мг препарата на (9,9+/-0,98)*109 лейкоцитов.
Рисунок 6. Подавленная миграция аутолейкоцитов
Как видно из рисунка 6 миграция нейтрофильных гранулоцитов из лунки отсутствует, индекс миграции равен нулю.
Таким образом, впервые была изучена миграционная активность нейтрофильных гранулоцитов пациентов с распространенным фурункулезом, инкубированных с антибиотиком ex vivo. Выявлено отсутствие влияния антибиотика и оптического воздействия излучения гелий-неонового лазера на миграционную активность нейтрофильных гранулоцитов. Полученные данные подтверждают, что нейтрофильные гранулоциты, нагруженные антибиотиком в ходе операции направленного транспорта, способны к передвижению хемотаксическим к очагу неспецифического воспаления.
3. ВЫВОДЫ.
1. Антибактериальный химиопрепарат, добавленный в цитовзвесь, как в присутствии излучения гелий-неонового лазера, так и без него, не влияет на миграционную способность лейкоцитов.
2. Аутолейкоциты пациентов с очагами неспецифического воспаления являются оптимальными "контейнерами" для транспортировки антибактериальных препаратов к очагу неспецифического воспаления.
Список литературы
1) Бельских А.Н., Потапчук В.Б. Совместное применение антибиотиков и экстракорпоральных методов детоксикации в гнойно-септической хирургии // Сб. трудов 9-го ежегодного Санкт-Петербургского нефрологического семинара. - СПб., ТНА, 2001
2) Ержанов О.Н., Швецов Д.А., Даниярова Б.А. Введение антибиотиков в клеточной взвеси крови при плазмаферезе в лечении острых абсцессов лeгких, осложнeнных пиопневмотораксом. // Тр. 3-го Рос. нац. конгресса "Человек и лекарство" - М., 1996. - С. 116.
3) Кузин В.Б., Борисов В.И., Прозорова В.К., Шалунов А.А. Введение в теорию фармакотерапии. Нижний Новгород, Издательство НГМА, 2002 г
4) Костюченко А.Л.,Бельских А.Н., Тулупов А.Н. // Интенсивная терапия послеоперационной раневой инфекции и сепсиса. - СПб.: Фолиант, 2000.
5) Лохвицкий С.В., Ержанова Ш.А., Балаболкин М.И., Сарафанова И.М. Направленный транспорт антибиотиков при лечении больных диабетической гнойной остеоартропатией // Сахарный диабет. - 1999. - ?3 (4).
6) Страчунский Л.С., Белоусов Ю.Б., Козлов С.Н. Антибактериальная терапия (практическое руководство), Москва, 2000 г
