На пути поиска программы и инициального субстрата старения

В статье приведены литературные и собственные данные авторов об общих свойствах механизма старения животных. На основании приведенных фактов проведен анализ наиболее распространенных моделей старения животных. Показано, что ни одна из них, включая привлекающую наибольшее внимание модель маргинотомии А.М.Оловникова, не в состоянии предсказать все реально наблюдаемые особенности механизма старения.

Из рассмотренных данных сделаны заключения о том, что существует специальный механизм старения и его pабота определяется не только генами, но и определенными некодирующими белки последовательностями генома, сама структура которых допускает значительные вариации. Начало старения животных обусловлено повреждениями ДНК, локализованными в нервных клетках, вероятно, в минорной фракции генома.

Старение животных относится к числу фундаментальных признаков их онтогенеза. Старение гарантирует смерть организма и, следовательно, обеспечивает одно из главных свойств живой материи - ее дискретность во времени. Однако в настоящее время биология старения не занимает ведущих мест среди других биологических дисциплин. Такое положение во многом объясняется объективными трудностями, которые необходимо преодолевать исследователям. Главная из них состоит в том, что при старении изменяются многие структуры и функции организма и поэтому трудно определить, что же является клеточным и молекулярным инициальным субстратом старения. Кроме того на сам процесс старения, в частности на его скорость, оказывают влияние многие гены и факторы среды [4]. Отсюда проистекает и обилие различных гипотез (их десятки, а может быть, и сотни) о природе старения. Большинство таких гипотез может быть легко опровергнуто в ходе самых предварительных дискуссий и поэтому не нуждается в экспериментальном обосновании.

Критическому обзору наиболее популярных моделей старения, а также доказательству существования программы старения и определению ее локализации в геноме, а также поиску субстрата старения посвящена настоящая работа. Может ли эта программа (если она существует, ниже мы вернемся к этому вопросу) содержаться только в генах, кодирующих белки? Как ,будет показано далее, установить локализацию первичного субстрата и программы старения прямыми исследованиями не удалось. Поэтому исследование механизмов старения приходится проводить по методу изучения "черного ящика", в первую очередь собирая все сведения о характерных чертах и результатах его работы.

Важность и надежность механизма старения и смерти

Старение и смертность обеспечивают выполнение одного из главных законов организации живой материи на Земле - закона дискретности и непрерывности ее в пространстве и времени [8]. Другими словами, жизнь на Земле представлена индивидуальными носителями, имеющими конечный срок своего существования, то есть смертными. Дискретность в пространстве нарушается в норме у видов, имеющих половой процесс, лишь при оплодотворении, когда происходит слияние половых клеток мужского и женского организмов, принадлежащих одному виду. Интересно при этом, что оплодотворение необходимо для обеспечения непрерывности живой материи во времени. Непрерывность живой материи обеспечивается, как это впервые постулировал Вейсман [5], особыми свойствами половых клеток.

Итак, старение это по-существу процесс, реализующий смертность, то есть временную дискретность организмов, необходимую для смены поколений. Без этого виды не могут сколь-либо длительно приспосабливаться к изменениям окружающей среды. В этом аспекте смертность животных можно отнести к инвариантным константам, которые допускают и обеспечивают появление и сохранение жизни на Земле [22]. Особенность биологических констант заключается в том, что все они так или иначе записаны в ДНК, ибо только через эти молекулы осуществляется информационная и отчасти материальная преемственность живой материи.

Неизбежность смерти обеспечивается дублированием механизмов старения. Можно отметить следующие факты:

1. В природе практически все животные умирают от случайных причин, не доживая до срока, определяемого основным механизмом старения, строго его можно исследовать только в лаборатории. Это, конечно, не означает, что старение - чисто лабораторный феномен. Пожалуй, правильно считать, что как раз в природе старение действует как фактор, увеличивающий вероятность смерти. Снижение приспособительных возможностей организма приводит к быстрой гибели начавшей стареть особи из-за действия внешних факторов, и смерть животных в природной популяции неизбежна вследствие случайных "атак" внешней среды. Последнее положение доказывают кривые выживания животных в дикой природе - они весьма близки к логарифмическим [28].

2. Некоторые виды имеют особые механизмы смерти, например, нерестовая гибель тихоокеанских лососей или угрей. Однако при выключении специальных механизмов, эти особи не становятся бессмертными, а умирают в результате нормального старения.

3. Вероятнее всего, смерть животных наступает вследствие изменений в постмитотических клетках - нейронах и сердечной мышце. Что, однако, произойдет, если мы сможем предотвратить эти изменения? По всей видимости, в этом случае рано или поздно исчерпается репродуктивный потенциал камбиальных клеток - лимит Хейфлика - и смерть организма все равно будет неизбежной, так как прекратится возобновление клеток в делящихся тканях, например,кишечном эпителии.

4. Соматические клетки могут быть избавлены от лимита на число делений, однако трансформация, in vivo сопровождающаяся иммортализацией таких клеток, приводит к неизбежной гибели организма от злокачественных опухолей.

Универсальность старения

Процесс старения присущ всем эукариотам. Его подробно изучали на таких разных организмах как инфузории, вольвокс, черви, насекомые, рыбы, млекопитающие [16], и даже на индивидуальных клетках дрожжей [20, 55, 68].

Действие механизма старения животных и человека проявляется в расстройстве регуляции первоначально клеточных, а затем и организменных систем, что ведет к снижению приспособительных возможностей организма [15, 28], то есть к сужению диапазона совместимых с жизнью параметров внешней среды.

Patnaik [78] указывает на сходство старения рептилий и млекопитающих. Об универсальности механизма старения говорит и сходство признаков старения всех млекопитающих - изменение гормонального статуса [60] стирание зубов, поседение и облысение, помутнение хрусталика глаза, накопление межклеточного коллагена, увеличение количества липофусцина в клетках. В определенных участках головного мозга происходят сходные изменения структуры и функционирования нейронов [71].

Весьма сложно сравнить протекание процесса старения у таких разных организмов, как насекомые и млекопитающие. Между тем, динамика смертности, проявляющаяся в кривых выживания, у них поразительно сходна [14]. Более того, Austriaco [20] утверждает, что аналогичную динамику смертности имеют индивидуальные клетки дрожжей. Динамика смертности отражает распределение случайной величины - вероятности гибели особей из исследуемой популяции по времени. В природе распределения вероятностей очень многих событий имеют одинаковое - нормальное, или Гауссово - распределение. Это всегда верно, когда изучаемое событие является следствием многих других независимых событий. Динамика смертности достоверно отличается от распределения Гаусса. Это доказывается тем, что кривые выживания имеют не равный 0 эксцесс и отличную от 1 ассиметрию [11]. Следовательно, смерть не есть следствие случайных процессов (например, просто накопления тех или иных случайных повреждений), но результат работы определенного механизма. Совпадение безразмерных кривых выживания дает основания для предположения о том, что механизм старения и смерти различных видов имеет некую общую основу.

Из сказанного выше можно заключить, что старение - универсально, что обосновывает необходимость поиска общего для всех эукариот механизма действия этого процесса.

О потенциальном бессмертии зародышевых клеток

Главная эволюционно - биологическая особенность половых клеток была установлена Вейсманом [5]. Он постулировал, что соматические клетки "должны умирать, когда протекло время жизни той особи, которой они принадлежат", тогда как половые (зародышевые) клетки "потенциально бессмертны...то есть они могут при благоприятных условиях вновь создать из себя заpодышевые клетки новой особи и так до бесконечности...".

Мы полагаем [2], что в современных терминах теория Вейсмана может быть сформулирована следующим образом. Соматические клетки по достижении конечной диффеpенциpовки теряют репродуктивный потенциал, и с этого момента они обречены на гибель. В то же время в пределах времени существования вида репродуктивный потенциал клеток germ line сохраняется. Спермий - несомненно высоко дифференцированная клетка служит прекрасным связующим звеном между поколениями организмов. В то же время многие факты, например, касающиеся функционирования хроматина, показывают неидентичность геномов зиготы и соматических клеток. Так у Cyclops kolensis, геном соматических клеток составляет всего 6% от такового germ line [6].

Влияние генотипа на продолжительность жизни

В настоящее время у дрозофилы обнаружено около 50 генов, мутации в которых влияют на продолжительность жизни, в основном снижают ее. Они локализованы в 10% генома. Отсюда сделано формальное заключение, что всего таких генов может быть до 500 [65]. По нашему мнению, далеко не все из этих генов имеют прямое отношение к естественному старению, так как и причины смерти животных, и динамика их смертности при наличии таких мутаций часто отличны от контрольных.

Helfand et al. [49] показали, что работа некоторых генов взрослой дрозофилы (в постмитотических клетках) разворачивается по строгому графику. Причем, при изменении продолжительность жизни исследуемой линии в три раза, адекватно меняются и графики работы этих генов.

В работе Lithgow [64] описана единичная мутация, увеличивающая продолжительность жизни у Caenorhabditis elegans. Автор отмечает, что увеличивающие ее мутации существенно изменяют фенотип, в частности, повышают устойчивость к стрессам. Ebert et al. [35] путем изучения продолжительность жизни потомков гибридов долго и -короткоживущих нематод с предварительно идентифицированными на генной карте пятью областями, ответственными за эту величину, и последующими реципрокными скрещиваниями, нашли 10 локусов, ответственных за продолжительность жизни. Авторы отмечают, что ее увеличение скоррелировано с повышением уровня каталазы и супероксиддисмутазы у старых нематод. Особенно интересна работа Johnson et al. [54], авторы которой нашли у нематоды ген, нормальная работа которого сокращает продолжительность жизни - "age-1", мутация в нем на 70% увеличивает эту величину.

В работе [83] Shook et al. исследовали продолжительность жизни нескольких мутантов нематоды и их гибридов. Показано, что вариация средней продолжительности жизни на 90% определяется генетической компонентной. В обзоре [53] Jazwinski приходит к выводу, что старение - сложный, обусловленный геномной регуляцией процесс. Тот факт, что у монозиготных близнецов наблюдается конкордантность по продолжительности жизни также рассматривается как доказательство генетической обусловленности старения [28]. Однако нельзя не отметить, что коэффициент наследования по этому признаку крайне низок: у самых различных видов он не превышает 0.35 [39].

Средняя продолжительность жизни - четкий видовой признак.Этот факт твердо установлен, доказательства подробно описаны в работах [28, 39]. Smith в статье [84] рассматривает возможные причины ее быстрого роста в ходе эволюции приматов. Кроме того, сделано косвенное заключение, что в эволюции гоминид, в период, предшествующий становлению Homo sapiens, продолжительность жизни резко возросла за весьма короткий эволюционный срок [30]. Продолжительность жизни ни как не связана с размерами генома: продолжительность жизни людей и мышей различается на два порядка, а размеры генома у них практически одинаковы.

Коppеляция продолжительности жизни с эффективностью работы систем pепаpации ДНК

Многие авторы наблюдали корреляцию эффективности pепаpации и этой величины [9, 19, 40, 41, 42, 43], однако назвать это универсальным правилом нельзя [80, 23].

В работе [80] показано отсутствие прямой связи между эффективности репарации и продолжительности жизни. Bohr, Anson [23] изучая корреляции между повреждениями ДНК, эффективностью репарации и старением, указывают, что репарация различных участков ДНК имеет разную скорость и дает разные результаты.

Martinez [69] справедливо указывает, что сравнение эффективности репарации ДНК и продолжительности жизни разных видов является слабым доказательством причинной обусловленности. Более прямое доказательство - увеличение продолжительности жизни при увеличении эффективности репарации у одного вида. Нанося повторные повреждения бесполым кольчатым червям Paranais litoralis, автор добился увеличения продолжительности жизни червей. Он полагает,что, полученный эффект есть следствие стойкой активации эксцизионной репарации ДНК.

Murakami, Johnson [72] исследовали несколько долгоживущих мутантов нематоды - Caenorhabditis elegans и обнаружили, что у некоторых из них снижена плодовитость, но не у всех. Однако все они обладали повышенной устойчивостью к УФ, на основании чего авторы заключили, что УФ устойчивость и продление жизни обеспечивается одним механизмом. Zahn et al. [91] модифицированным методом щелочной элюции показали, что в различных тканях старых мышей увеличено число щелочелабильных сайтов и снижена репарация после обработки нитрооксихинолином. Особенно ярко выражены эти изменения в клетках мозга и сердца. Moriwaki et al. [70] показали, что в фибробластах человека с возрастом донора линейно снижается способность к репарации УФ - повреждений ДНК и растет мутабильность (изучены доноры от 10 до 100 лет). Toussaint, Remacle [85, 86], развивая гипотезу катастрофы ошибок Оргеля [28], указывают на важную роль репарации в определении продолжительности жизни.

О влиянии искусственного отбора на продолжительность жизни

В последние годы определенными успехами увенчались попытки провести селекцию на увеличение продолжительность жизни дрозофилы. Zwaan, Bijlsma, Hoekstra [92] удалось провести прямую селекцию на увеличение и снижение продолжительности жизни, причем результат ее оказался не скоррелированным ни с ранней, ни с поздней плодовитостью. В работе [92] приведен обзор более или менее успешных экспериментов, направленных на отбор мух с увеличенной продолжительностью жизни. В то же время Baret, Lebourg, Lints [21] выражают сомнения в некоторых результатах селекции дрозофилы по продолжительности жизни, полагая что такая селекция невозможна в принципе. Однако их мнение представляет собой скорее исключение.

Djawdan, Sugiyama [33], провели селекцию на увеличение продолжительности жизни дрозофилы, связанное с поздней плодовитостью мух. Hasson, Fanara [48] показали, что природные популяции мух, имеющие различия в длине торакса, различаются и по продолжительности жизни. Корреляция между продолжительностью жизни и длиной торакса положительная. Обнаруженные различия генетически обусловлены. Chippindale et al. [26], напротив, корреляции между продолжительностью жизни и весом при рождении или длиной торакса у 24 различных линий D. melanogaster не обнаружили. Однако среди этих линий долгожители имеют увеличенное на 12% время развития. Важно отметить, что при селекции на увеличение продолжительности жизни (по поздней плодовитости) не обнаруживается ни накопления мутаций, ни инбредной депрессии. Leroi et al. [62] провели детальный анализ корреляций между ранней или поздней плодовитостью, продолжительностью жизни и устойчивостью к голоданию дрозофил, а также влияния отбора по первому признаку на два остальных. Авторы показали, что упомянутые корреляции наблюдаются не всегда, и в определенных условиях возможен отбор дрозофил на увеличение продолжительности жизни без снижения ранней плодовитости мух.

Анализ вариации индивидуальной продолжительности жизни в популяциях и средней продолжительности жизни популяции от поколения к поколению

Несмотря на устойчивость средней продолжительности жизни как видового признака, особи синхронной популяции (имеющие одинаковый возраст и живущие в стандартных условиях) не умирают одновременно. Коэффициент ваpиации кривых выживания самых разных видов лежит в пределах 0.2-0.3 [39]. Более того, Lints et al. [59] в Бельгии и одновременно Д.М.Измайлов с соавт. [51, 52] в Институте химической физики РАН показали, что у дрозофилы происходят значительные спонтанные вариации продолжительности жизни от поколения к поколению без изменения формы кривых выживания. Причем в экспериментах Измайлова с соавт. насекомые разных поколений изучались в одинаковых условиях и практически одновременно.

Curtsinger et al. [29] также приводят примеры вариации продолжительности жизни у многих организмов и обсуждают генетическую природу этой изменчивости. В обзоре Phelan, Austad [79 ] рассмотрены вариации у линейных животных и их причины. Указано, что гибриды F1 инбредных линий более однородны. Однако конкретные причины таких вариаций продолжительности жизни до сих пор не известны.

Важно подчеркнуть, что основной вклад в вариацию продолжительности жизни вносит собственно механизм старения, а не генетическое разнообразие популяций. Это следует из того, что вариация продолжительности жизни внутри инбредных линий превышает межлинейную [39]. Особенно ярко это положение можно проиллюстрировать, сопоставив вариации по продолжительности жизни среди монозиготных (0.19) и дизиготных (0.25) близнецов [39].

Возникновение и эволюция процесса старения

Совершенно неясен вопрос о возникновение и эволюция процесса старения. Есть точка зрения, согласно которой гены моpтальности возникли с появлением многоклеточности и дифференциации функций между тканями [32] Естественный отбор у животных не может воздействовать на процессы, проявляющие себя только в пострепродуктивном периоде, а потому не может воздействовать на процесс старения [28].

Игнорируя это фундаментальное свойство старения, как и то, что естественный отбор сугубо индивидуален, Nusbaum [75] предполагает, что старение может быть результатом положительной селекции, так как этот процесс дает потенциальные эволюционные преимущества - возможность замены одних видов на другие. Rattan et al.[82] рассматривают вопрос о том, как генетически обусловленный процесс - старение - мог стать видовым признаком без действия отбора. В итоге автор приходит к старой теории плейотропности генов, называя это модным термином "виртуальное" старение.

Характерную ошибку в своих рассуждениях допускает Parsons [77]: он предсказывает невозможность увеличения продолжительности жизни человека на основании того, что на Homo sapiens слабо действует естественный отбор. Из этого рассуждения следует, что в природных популяциях животных, где естественный отбор действует эффективно, должна увеличиваться продолжительность жизни. На самом деле этого не происходит, поскольку признаки, проявляющие себя в пострепродуктивном периоде не, могут быть закреплены в ходе эволюции.

Потенциальная фаза старения

На основании собственных и литературных данных о динамики смертности дрозофилы в норме и после -облучения, а также об изменении со временем числа дефектов вторичной структуры ДНК клеток постмитотических тканей мышей в норме и после -облучения, мы пришли к выводу о существовании потенциальной фазы старения [14] - периода, когда нет явных фенотипических проявлений старения: снижения репродукции, адаптивных возможностей, смертности, но определенные изменения организма происходят. Изменяется поведение, "запоминаются" и мутагенные и антимутагенные воздействия, сокращающие и увеличивающие продолжительность жизни, причем не просто "запоминаются", но и усиливаются (аналогичные воздействия в позднем возрасте менее результативны).

ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА ПРОЦЕССА СТАРЕНИЯ ЖИВОТНЫХ

Анализ данных литературы и результатов наших собственных исследований позволили нам сформулировать основные свойства процесса старения.

1. Смертность животных относится к инвариантным константам, которые обеспечивают появление и сохранение жизни на Земле. Механизм старения очень надежен.

2. Всеобщность и сходство характеристик старения у млекопитающих, универсальность динамики смертности у представителей разных классов животных.

3. Дифференцировка эукариотических клеток животных на нестареющие половые и ответственные за старение соматические.

4. Старение - генетически обусловленный процесс с низким коэффициентом наследования. Средняя продолжительность жизни - четкий видовой признак.

5. Коppеляция продолжительности жизни с эффективностью работы систем pепаpации ДНК.

6. Возможны искусственный отбор по продолжительности жизни, а также быстрое изменение продолжительности жизни в эволюции.

7. Возможно значительное изменение средней продолжительности жизни популяции от поколения к поколению одной линии без всяких внешних воздействий. Вариация индивидуальной продолжительности жизни сохраняется у инбредных линий и монозиготных близнецов, хотя у них есть и определенная конкордантность по продолжительности жизни. Одинаковая вариация продолжительности жизни в популяциях разных видов.

8. На процессы старение не действует естественный отбор, так как их фенотипические проявления относятся к пострепродуктивному периоду.

9. Мы установили, что как процесс старения, так и радиационного укорочения жизни, имеют потенциальную фазу - период, когда они развиваются, но никак себя не проявляют.

10. К перечисленным выше свойствам следует добавить еще одну особенность механизма старения - облучение ионизирующей радиацией в ограниченных дозах постмитотических тканей организма может укорачивать продолжительность жизни без искажение естественного старения [12], а воздействие антиоксидантами - увеличивать [7]. Эта особенность механизма старения позволяет предположить, что в процессе старения важную роль играет не только генетический механизм, но и его взаимодействие со стохастическими повреждениями [1].

НЕКОТОРЫЕ ГИПОТЕЗЫ О МЕХАНИЗМАХ СТАРЕНИЯ

Число гипотез о природе старения весьма велико - десятки или сотни. В рамках настоящей работы мы коснемся лишь некоторых из моделей старения, так или иначе учитывающих роль генетического аппарата в этом процессе. Проанализируем наиболее распространенные модели старения с точки зрения соответствия перечисленным выше основным свойствам этого процесса.

Наибольшее внимание в наши дни привлекает теломерная гипотеза А.М. Оловникова, впервые высказанная более 25 лет назад [10]. Ее автор предположил, что в соматических клетках при каждой репликации из-за особенностей работы ферментов репликации (ДНК - полимеразы) недореплицируются концы хромосом - теломеры. В конце концов в результате постоянного укорочения хромосом при каждом митозе, недорепликация¹ захватывает области генома, существенные для выживания клеток, что и приводит к гибели клеток и старению организмов. Современные модификации этой гипотезы изложены Allsopp [18a] и ее модификация - Vaziri, Benchimol [88]: по мнению этих авторов укорочение теломер активирует синтез белка p53, количество которого действительно увеличивается при старении культивируемых клеток MDF. Этот белок запускает синтез ряда других, что и приводит к блоку клеток в G1 и старению.

Более 10 лет назад у инфузорий был обнаружен фермент ДНК нуклеотидтрансфераза (теломераза), достраивающий 3' концы линейных молекул ДНК хромосом короткими повторяющимися последовательностями. Позже и у других эукариот, в том числе в клетках человека, нормальных и иммортализированных раковых клетках HeLa [90] был также обнаружен этот фермент. Интересно, что помимо белковой части, теломераза содержит РНК, которая выполняет роль матрицы для наращивания ДНК короткими повторами. Такой процесс в половых и раковых клетках защищает генетически значимые участки хромосом. Это по сути своей и есть механизм смерти и бессмертия на клеточном уровне, первоначально разработанный Оловниковым [10]. Оказалось, что размер теломерной ДНК сперматозоидов не уменьшается с возрастом мужчин, тогда как в стареющих культурах нормальных фибробластов человека теломерные участки укорачиваются [56].

Недавно американские ученые [24] сообщили о том, что с помощью генно - инженерных методов удалось в нормальные, то есть стареющие со временем, клетки человека in vitro ввести и заставить экспрессироваться ген теломеразы. Это привело к увеличению в полтора раза числа циклов репродукции этих клеток.

Если считать, что этот механизм старения животных и человека, пусть не единственный, но главный, равно как и теломеразная защита хромосом germ line обеспечивает информационную преемственность в ряду поколений, то задачи дальнейших поисков заметно сужаются. Нейроны мышей проходят последние митотические циклы на 18-ые сутки беременности. Клетки нервных ганглиев дрозофилы делятся последний раз в личиночном периоде, а тканевые клетки имаго - это целиком постмитотические популяции. Поскольку в подавляющем большинстве дифференцированных соматических клеток активность теломеразы не выявляется [63], то, если строго подходить к предсказаниям теломерной гипотезы, следует заключить, что старение указанных клеток завершается сразу же после последней маргинотомии. Другими словами, ДНК нейронов новорожденных мышей полностью соответствует по степени поврежденности теломер ДНК старых животных. Следовательно, сами нейроны молодых животных по своим морфологическим и функциональным особенностям должны быть точно такими же, как и у стариков.

Понимая абсурдность такого предположения, Оловников выдвинул идею о том, что маргинотомия сопровождает не только репликативный, но и репаративный синтез [76].

Посмотрим, насколько хорошо гипотеза Оловникова согласуется с общими свойствами старения, перечисленными в предыдущем разделе: п. 2: теломеразная гипотеза предсказывает всеобщность старения, т.к. хромосомы всех многоклеточных имеют теломеры. Динамика смертности (распределение вероятности смерти по времени) согласно этой гипотезе будет универсальной, т.к. не участвующие в синтезе белков теломеры различных видов скорее всего имеют одинаковую форму распределения по длине, и различную среднюю длину у разных видов, что обеспечит им различную среднюю продолжительность жизни. П. 3: с точки зрения теломерной гипотезы дифференцировка клеток на нестареющие половые и стареющие соматические объясняется тем, что в первых, в отличие от вторых, работает теломераза, однако эта гипотеза не объясняет, почему в геноме половых клеток за миллионы поколений не накапливаются повреждения. Накопление мутаций, других повреждений генома и снижение репаративной активности в соматических клетках при старении надежно показано, так же, как и отсутствие таких событий в половых клетках при чередовании поколений. П. 4: хорошо согласуется с этой гипотезой, поскольку длинна теломер потомков полностью определяется этим же параметром у родителей, а у монозиготных близнецов и вовсе одинакова. П. 5: не согласуется с этой гипотезой - интенсивность репарации и скорость укорочения теломер, если следовать модифицированной гипотезе А.М.Оловникова, могут быть только обратно пропорциональны, в то время как интенсивность репарации часто прямо пропорциональна продолжительности жизни. В предельном случае мутантные линии без эксцизионной репарации, согласно этой гипотезе, не должны стареть, смерть их особей может быть обусловлена только случайными причинами, а кривые выживания будут экспоненциальными. В действительности это не происходит. Недавно Kruk [57] показал, что и в теломерных участках хромосом имеет место репарация, хотя и менее интенсивная, чем в активных генах, но более интенсивная, чем во всех остальных. Martinez [69] показал наличие положительного влияния искусственного стимулирования репарации на продолжительность жизни. П. 6 : естественно, что возможна селекция по наследуемому признаку - длине теломер, а , следовательно, и по продолжительности жизни. Мы полагаем, что эта гипотеза противоречит п. 7: непонятно, как может быть низким коэффициент наследования длины теломер, почему эта длинна различается у животных инбредных линий и, тем более, у монозиготных близнецов [68]. Также не ясны причины возможного резкого изменения длины теломер при смене поколений.П. 9: эта гипотеза предсказывает наличие плато на кривых выживания при естественном старении, поскольку до тех пор, пока теломеры не будут разрушены, изменений в функционировании клеток, а, следовательно, жизнеспособности организма не будет.

П. 10 Однако принципиально иная картина должна, в согласии с гипотезой маргинотомии возникать при радиационном укорочении жизни. Эта гипотеза предсказывает наличие плато на кривых выживания при естественном старении, поскольку до тех пор, пока теломеры не будут разрушены до неких критических пределов, изменений в функционировании клеток, а, следовательно, жизнеспособности организма не будет. Однако принципиально иная картина должна, в согласии с гипотезой маргинотомии возникать при радиационном укорочении жизни.

В пролиферирующих тканях 1 аберрация хромосом на клетку возникает после облучения в дозах 4-5 Гр [37]. Тогда при сохранении линейной дозовой зависимости под действием облучения в дозе 500 Гр, когда в эксперименте не наблюдается изменение формы кривой выживания (хотя и снижается средняя продолжительность жизни), в ядрах клеток нервных ганглиев должно быть примерно по 10 аберраций (число разрывов пропорционально размеру генома). В последние годы с помощь методов молекулярной цитогенетики И.Д.Александров и соавт. [3] обнаружили на D. melanogaster, что радиационные разрывы хромосом, ведущие к формированию аберраций, регулярно локализуются внутри генов, причем нередко их кластеры обнаруживаются в областях определенных последовательностей внутри интронов. Делеции различной величины фланкируют разрывы у 20% обменов. Укорочение новых концов хромосом (радиационные разрывы), расположенных вблизи или даже внутри генов и не защищенных теломерными участками, при маргинотомии, сопровождающей дальнейшую репарацию, несомненно приведет к быстрой гибели насекомых. О сохранении плато на кривых выживания при радиационном укорочении жизни [12], если верна гипотеза Оловникова, не может быть и речи.

Таким образом, механизм старения по Оловникову не обеспечивает возможности проявления ряда свойств этого процесса, которые наблюдаются в реальной жизни. К достоинствам этой гипотезы следует отнести возможность ее экспериментальной проверки. Достаточно измерить длину теломер в постмитотических клетках молодых и старых доноров (гипотеза предсказывает их укорочение), а также проверить, является ли, согласно предсказаниям гипотезы, прекращение работы некоторых генов и гибель клеток причиной смерти организма. Непосредственные измерения теломерных участков показали, что у мыши они значительно длиннее, чем у человека, хотя продолжительность жизни последнего в 50 раз больше. Кроме того, хотя теломерные участки в клетках крови человека укорачиваются с возрастом, в мышечных клетках человека [31] и мыши такого не найдено. Нет укорочения теломер и при клональном старении одиночных клеток дрожжей [39].

Принимая во внимание указанные соображения, можно заключить,что теломеразная гипотеза имеет отдаленное отношение к сущности старения. Она может быть предложена в качестве одного из объяснений причины существования лимита на число делений соматических клеток (лимита Хейфлика).

Продолжает активно разрабатываться свободно - радикальная гипотеза [45 - 47], впервые предложенная Н.М.Эмануэлем [17] и Harman [44]. Суть ее в том, что старение обусловлено повреждением макромолекул клеток под действием собственных свободных радикалов, которые в норме образуются в качестве побочных продуктов метаболизма в каждой клетке.

Не забыта до сих пор одна из первых генетических гипотез о механизме старения - гипотеза о плейотропности действия генов [28]. В ее основе лежит предположение о том, что действие некоторых генов имеет противоречивые последствия: будучи полезными в начале жизни эти гены со временем становятся смертельно опасными для их обладателя. Естественный отбор закрепляет эти гены благодаря их полезному действию или необходимости для молодых особей.

В современных работах Charlesworth, Hughes [25] и Tower [87] сопоставляются плейотропная гипотеза и концепция накопления мутаций как причины старения. Особенно популярно в последнее время представление об "антагонистической плейотропности" между ранней плодовитостью и долговечностью [92]. Djawdan et al. [33] предполагают, что эта плейотропность может существовать благодаря обмену в распределении энергии между воспроизведением и выживанием. Однако авторы указывают, что количественные соотношения между плодовитостью и продолжительностью жизни, предсказанные теоретически, не совпадают с полученными в эксперименте.

Это и не удивительно, поскольку еще в 1966 г Lamb показал, что обратная корреляция продолжительности жизни и плодовитости у дрозофил наблюдается только в стандартных для генетических экспериментов условиях содержания [58]. При содержании насекомых на обогащенной среде или при очень частых (через сут вместо одного -двух раз в неделю) пересадках на свежую среду продолжительность жизни плодовитых насекомых увеличивается и даже несколько превышает продолжительность жизни бесплодных (мутантов или стерилизованных небольшой дозой радиации) дрозофил. Отсюда автор сделал вывод о том, что ресурсы, одновременно необходимые для размножения и увеличения продолжительности жизни, содержатся в питательной среде, и только при их недостатке увеличение плодовитости снижает продолжительность жизни.

Ю.П. Алтухов [4] обсуждает корреляции между четырьмя факторами: гетерозиготностью генотипа, возрастом первой репродукции, размерами тела и продолжительностью жизни. Все эти четыре параметра для большого набора совершенно различных организмов (насекомых, рыб, млекопитающих, растений) попарно хорошо скоррелированы. В качестве основного, определяющего три остальные параметра, автор рассматривает аллозимную гетерозиготность.

Charlesworth, Hughes [25] пытаются на основе экспериментальных данных сделать выбор из двух моделей: теории старения "disposable soma" (по существу, обновленная теория накопления мутаций) и теории "антагонистической плейотропности". Однако ни одна из них по отдельности, по мнению авторов, не дает возможности удовлетворительно описать приведенные данные. Curtsinger, Fukui [29] в своем обзоре указывают, что эти модели старения - "антагонистическая плейотропность" и накопление мутации, не имеет реальной экспериментальной поддержки.

По мнению многих авторов, старение вызывается накоплением случайных повреждений в геноме. Гипотезу о первичности в старении стохастических повреждений ДНК в последнее время называют теорией старения "disposable soma".

Для проверки теории старения "disposable soma" Martinez [69] показал наличие положительного влияния искусственного стимулирования репарации на продолжительность жизни. Автор стимулировал репарацию путем повторяющегося повреждения у бесполого червя Paranais litoralis. Так как стимуляция репарации ведет к увеличению продолжительности жизни, автор полагает, что его данные подтверждают теорию старения "disposable soma" Abrams, Ludwig [18] добавляют к этой гипотезе еще одно положение: "эволюционная теория старения disposable soma " предполагает, что старение является результатом оптимального баланса ресурсов между воспроизведением и соматической репарацией. Причем в этой работе теоретически предсказывается, что теория старения "disposable soma" может предсказать распределение смертности по закону Гомперца только в виде исключения.

Рассмотрев широкий набор гипотез о механизмах старения, Toussaint, Remacle [86] пришли к выводу, что все они могут быть интегрированы в более общее понятие, каковым является концепция критического порога накопления ошибок, принимающая во внимание защитную роль систем репарации.

Мы не будем рассматривать все перечисленные гипотезы так же подробно, как гипотезу А.М.Оловникова. Однако отметим, что все гипотезы о первичной роли стохастических повреждений не согласуются с фактами, доказывающими, что существует генетически определенный механизм старения. Из списка свойств старения они не могут объяснить существования пп 1, 2, 3, 4, 9.

В этой связи особый интерес привлекает транспозонная гипотеза старения Кирквуда[56, 73]. Автор предположил, что транспозоны при перестройках не только перемещаются в геноме с места на место, а удваиваются, вследствие чего их число в геноме экспоненциально растет со временем в течение жизни. Пока число транспозонов мало, невелика и вероятность того, что перестройка затронет функциональную активность жизненно важных генов. Размножение транспозонов происходит в пределах избыточной ДНК, поскольку ее количество в геноме многих эукариот во много раз превышает размеры кодирующих белки областей и регуляторных участков. Размножение транспозонов вызывает экспоненциальный рост вероятности того, что будут затронуты гены, что и приводит к росту со временем вероятности гибели клеток, старению и смерти организма. Мы полагаем, что период, когда транспозоны размножаются в молчащей ДНК, можно рассматривать как потенциальную фазу старения. В половых клетках при прохождении мейотического кроссинговера избыточные транспозоны удаляются, что приводит к восстановлению репродуктивного потенциала этих клеток. Возможность удаления "новых" транспозонов обусловлена тем, что в гомологичных хромосомах они располагаются в разных сайтах. Из-за этого при кроссинговре образуются однонитевые петли, которые могут быть удалены ферментами репарации.

Значительный интерес с нашей точки зрения представляют данные об изменениях первичной структуры генома за счет мобильных элементов с возрастом. Так Egilmez, Reis [34] показали, что у нематоды в течение жизни в 14 раз возрастает эксцизия элемента Тс-1. Clark, Guadalupe [27] показали, что вставка в случайные места генома блока из 48 Р-элементов приводит к разнообразным изменениям продолжительности жизни, причем увеличение продолжительности жизни в этом случае не сопряжено с поздней плодовитостью. Woodruff, Nikitin [89] также указывают на то, что перемещение Р-элемента приводит к сокращению продолжительности жизни дрозофилы. Работа Nikitin, Woodruff [74] дополняет приведенные данные : перемещение транспозона mariner приводит к сокращению продолжительности жизни дрозофилы D. simulans и не влияет на продолжительность жизни D. melanogaster.

В этой модели хотелось бы отметить два обстоятельства:

1. Для реализации процесса Кирквуда необходима молчащая ДНК; известно, что для организмов без молчащей ДНК (прокариоты и некоторые одноклеточные эукариоты) типичное старение не характерно.

2. Модель хорошо согласуется с тем, что факторы, случайным образом повреждающие ДНК, ускоряют процесс старения. Мутации генов от внешних повреждающих факторов суммируются с повреждением генов транспозонами.

Однако, если верна гипотеза Кирквуда, то скорость старения должна зависеть от исходного размера генома и числа транспозонов в нем. В таком случае, D.melanogaster, имеющая в 7 раз больше транспозоноподобных элементов, чем D.simulans, должна стареть намного быстрее вида - близнеца. Таким образом, модели Кирквуда также противоречат некоторые твердо установленные факты о старении.

В последнее время многие авторы пришли к пониманию важности анализа дисперсии кривых выживания для изучения механизмов старения. Некоторые гипотезы о старении позволяют предсказать возможные дисперсии кривых выживания и корреляции продолжительности жизни с рядом других признаков организмов. Используя эти теоретические предсказания, Hughes et al. [25, 50], анализируя дисперсии кривых выживания, а также распределений мух по весу и плодовитости и корреляции между этими признаками, по результатам сравнения теоретических предсказаний с экспериментальными данными, сопоставляют две теории старения - плейотропную и накопления мутаций. В первой из них отдается предпочтение теории накопления мутаций перед теорией "антагонистической плейотропности". Во второй работе сделана попытка такого сравнения через сопоставление дисперсий кривых выживания родственных линий дрозофилы. Однозначного ответа о преимуществе одной из теорий получить не удалось. В работе [81] Promislow et al. использовали анализ дисперсий для проверки гипотезы Medawar об ослаблении отбора. Суть этой гипотезы сводится к накоплению вредных мутаций с возрастом вследствие ослабления отбора с увеличением возраста. Поскольку реальная дисперсия смертности исследованных дрозофил не совпадала с теоретически предсказанной на основе этой гипотезы, гипотеза не подтвердилась. Lebourg [61] развивает применение анализа дисперсий и предлагает применять мультивариантный анализ в сравнительной геронтологии.

АНАЛИЗ МЕХАНИЗМА СТАРЕНИЯ

Универсальность, всеобщность и надежность работы механизма старения позволяют поставить задачу поиска единой модели механизма старения. Рассмотрим, какие свойства должна предсказывать модель старения. Приведенные в первом разделе факты, изложенные в пунктах 3 - 6 однозначно указывают на то, что продолжительность жизни определяется генетически: дифференцировка (п.3) характерные видовые признаки (п.4) и работа систем pепаpации (п.5) определяются генами, по которым возможна селекция (п.6). Существуют и прямые данные об участии сотен генов в определении продолжительности жизни.

Однако определяется продолжительность жизни исключительно генетически обусловленным запасом прочности организма или существует специальный разрушительный механизм старения? Многие ли из упомянутых выше генов имеют отношение к собственно механизму старения? Многие заболевания, в том числе и генетически обусловленные, приводят к сокращению жизни, не затрагивая фундаментальный механизм старения. Кроме того, по крайней мере некоторые мутации в генах, определяющих работу механизма старения, должны увеличивать продолжительность жизни. Пока известно лишь несколько таких генов у нематоды [39]. Реализуется ли механизм старения только через белки, заданные в генах, или для его протекания необходимы некие внегенные геномные структуры?

Для ответа на эти вопросы обратим внимание на некоторые упоминавшиеся ранее особенности старения:

1. Весьма широкая вариация продолжительности жизни линейных особей одной популяции (коэффициент вариации кривых выживания самых разных организмов - 0,2-0,3) возможна только при ответственности за признак большого числа генов. Когда причиной естественной гибели организмов являются несколько ферментов (работа небольшого числа генов), как у лососей во время нереста, вариация продолжительности жизни намного ниже, кривые выживания имеют "прямоугольную" форму.

2. Универсальность динамики смертности и точное сохранение всего спектра старческих изменений у различных млекопитающих (п 2) при возможном различие в продолжительность жизни в 50 раз и рост средней продолжительности жизни более чем в два раза в эволюции гоминид до человека с сохранением всего спектра старческих изменений при изменении не более 2% генов возможны только при том условии, что работу механизма старения определяет небольшое число генов.

3. Значительные спонтанные вариации средней продолжительности жизни внутри одной линии дрозофил от поколения к поколению без изменения формы кривых выживания (.п 7) вообще не характерны для генетически обусловленных признаков.

Указанные выше противоречия можно разрешить, если предположить, что специальный механизм старения существует и его pабота определяется не только генами, но и определенными некодирующими белки структурами генома, сама структура которых допускает значительные вариации.

Все это указывает на то, что конкретный механизм старения животных пока крайне трудно определить в привычных терминах классической молекулярной биологии.

Представление о том, что же в действительности служит инициальным субстратом старения, абсолютно необходимо для того, чтобы биология старения перешла на уровень современной молекулярной биологии. Четкое определение этого субстрата несомненно поможет анализу работы механизма старения. Так настоящий информационный взрыв в генетике начался с открытия субстрата наследственности - ДНК.

СУБСТРАТ СТАРЕНИЯ

Выше мы привели факты, свидетельствующие о существовании потенциальной фазы старения Для сохранения памяти и развития событий необходим материальный субстрат - субстрат старения. Она проявляет себя в том, что в соматических клетках сохраняется "память" о том, что за такой-то отрезок календарного времени в клетках накоплено некое количество повреждений, которое по достижении определенного порога приведет к проявлению видимых признаков старения. Повреждающие агенты - радиация и химические вещества - могут увеличить число таких повреждений и ускорить старение, тогда как защитные факторы, в частности, антиоксиданты окажут прямо противоположный эффект.

Мы обосновали , что длительное сохранение памяти о воздействиях возможно только в ДНК. Кроме того, исследуя радиосенсибилизацию БУДР по признаку радиационного сокращения продолжительности жизни, мы уточнили, что субстратом старения является ядерная ДНК нейронов [14]. Однако геном - слишком большое и сложное образование. Необходимо конкретизировать ответственные за старение участки.

ДНК и старение

Известно, что старение сопровождается накоплением повреждений и мутаций в соматических клетках. Многие авторы особое внимание уделяют анализу повреждений ДНК нейронов старых животных. Dolle at al. [34], исследуя ДНК печени и мозга трансгенных мышей, пришли к заключению, что число мутаций значительно возрастает только в ДНК печени мышей старше 27 мес. Увеличения числа мутаций в клетках мозга с возрастом авторы не обнаружили. На протяжении всей жизни мышей в ДНК печени было больше мутаций, чем в ДНК мозга. Mandavilli, Rao [67] показали, что число одно- и двунитевых разрывов ДНК, как спонтанных, так и индуцированных MNNG и глютаматом, возрастает в клетках различных областей мозга старых крыс по сравнению с молодыми. Причем особенно это заметно в клетках коры головного мозга. Эта же группа авторов [66] исследовала роль апоптоза в увеличении числа разрывов ДНК нейронов. Показано, что только после обработки MNNG и глютаматом апоптоз вносит свой вклад, тогда как при естественном старении механизм образования одно и двунитевых разрывов ДНК иной. Morrison, Hof [71] в результате детальных исследований нейронов головного мозга при старении пришли к заключению, что хотя гибель этих клеток и сопровождает старение животных и человека, она не является причиной этого процесса. Главным для старческих изменений функционирования мозга является искажение, но не прекращение работы генов, чьи продукты обеспечивают взаимодействие нейронов в цепи. Evans, Burbach, Vanleeuwen [38] обнаружили, что в нейронах крыс с возрастом накапливаются повреждения ДНК и снижается репарационная активность. Однако все же следует отметить, что обширные изменения ДНК, такие как протяженные однонитевые пробелы, обнаруженные Zahn et al. [91] (эти данные не были подтверждены), едва ли могут рассматриваться как характерные признаки изменения генома при старении. Если таковые изменения и есть, то они скорее всего носят иной характер, причем точно не известно, когда они появляются.

Нами впервые было показано, что дефекты вторичной структуры ДНК возникающие как при естественном старении, так и при радиационном укорочении жизни, в терминальной стадии локализованы в относительно АТ- богатых областях генома [13]. Это невозможно без действия специального механизма, так как случайно возникающие дефекты вторичной структуры располагаются по ДНК равномерно.

Тот факт, что рассмотренные дефекты вторичной структуры ДНК обнаруживаются в терминальной фазе старения, а также то, что наименьшее их количество появляется в критических при старении нервных клетках, наводит на мысль, что их нельзя отнести к первичным событиям старения. Вероятнее всего к инициальному субстрату старения они отношения не имеют, а являются последствиями работы механизма старения в фазе реализации. По всей видимости, субстрат старения локализован в минорной фракции ДНК, не обнаруживаемой современными методами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из сказанного очевидно, что настоящая работа по выяснению фундаментального механизма старения животных еще только начинается. На обсуждаемые проблемы можно посмотреть иначе, поставив вопрос следующим образом: что нужно сохранить в germ line, что бы обеспечить непрерывность смены поколений хотя бы в пределах одного вида. Ответ вполне ясен: возможность непрерывной передачи наследственной информации с помощью ДНК. Для этого ДНК постоянно в течение миллионов поколений в клетках germ line не должна терять способности к выполнению своих функций, в первую очередь репликации и транскрипции.

С другой стороны, потеря этих функций ДНК соматических клеток должна привести к их гибели, старению и смерти организма. Приведенные в настоящей статье факты и соображения не противоречат идее о том, что молекулярный субстрат наследственности - ДНК одновременно является субстратом старения животных. Недавно мы [2] рассмотрели в связи со старением еще один вопрос - внутреннюю причину видов в эволюции и пришли к заключению, что это широко известное явление также может быть обусловлено накоплением повреждений в germ line, протекающим, однако, с несравненно меньшей скоростью, чем при старении индивидуумов. Вымирание видов и смерть индивидуумов в тех биологических аспектах, с нашей точки зрения, составляет две узловые проблемы той дисциплины, которую мы предложили назвать биоэсхатологией. Задача предстоящего экспериментального этапа работ в этой области состоит в надежном, сравнимом с таковым в генетике, обоснованием роли ядерной ДНК, как инициального субстрата и в то же время носителя информации о самом фундаментальном механизме старения.