Жизнеспособность лейкоцитов крови пациентов с ишемической болезнью сердца в различных условиях их культивирования in vitro Medline.ru - медико-биологический информационный портал Медлайн.ру

Жизнеспособность лейкоцитов крови пациентов с ишемической болезнью сердца в различных условиях их культивирования in vitro

Ромащенко О.В.1, Надеждин С.В.1, Закирова Л.Р.1, Алфeров П.К.1,2, Казакова Е.Е.2, Пилькевич Н.Б.1, Грищенко Н.Д.1,2, Ветрова Е.К.2, Лаптева И.А.2, Стаценко Л.В.2, Гладкова М.Г.2, Саввина Ю.А.1, Морозова А.В.1, Бабанина А.К.1
1Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», 308017, г.Белгород, ул.Победы, д.85;
2Областное государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа», 308007, г. Белгород, улица Некрасова, дом 8/9

Резюме
С целью определения жизнеспособности лейкоцитов крови пациентов с ишемической болезнью сердца в различных условиях их культивирования in vitro было проведено исследование 33 образцов крови больных. При выполнении анализа было выделено 5 групп наблюдения: 1ю составили 30 пациентов, у которых были соблюдены все необходимые условия забора крови, отбора и транспортировки суспензии лейкоцитов, их культивирования и анализа, 2ю составил один больной, пробу которого «случайным образом» поставили инкубировать без поддержания соответствующего газового состава в термостате, 3ю составил один больной, которому «по ошибке» в лейкоцитарную суспензию была внесена питательная среда, контаминированная микробными агентами, 4ю составил один больной, у которого кровь была отобрана правильно, однако по технической причине анализ был выполнен на следующий день, т.е. анализу были подвергнуты «вчерашние» лейкоциты, простоявшие в условиях гипотермии (+4оС) в течение суток, 5ю составили 30 пациентов, которым в условиях in vitro в пробу с лейкоцитарной взвесью вносили препарат метаболического ряда цитофлавин в терапевтической концентрации. Материалы и методы исследования. Забор крови выполнялся утром натощак в вакуумную пробирку с ЭДТА. Лейкоциты крови отбирали в асептических условиях, смешивали с питательной средой RPMI-1640 с глутамином (компания ПанЭко, Россия), помещали в лунки для исследования под микроскопом. Препараты окрашивали флуоресцентными красителями: MitoTracker? Red CMXRos - позволяет оценивать митохондриальный мембранный потенциал; Сalcein АМ - окрашивает только жизнеспособные клетки; Ethidium bromide - окрашивает только мeртвые клетки. Пробы инкубировали в течение 3х часов в СО2 инкубаторе с 5%-ым содержанием СО2 при температуре 37?С. Результаты оценивали методами световой и флуоресцентной микроскопии при помощи инвертированного флуоресцентного микроскопа и специализированного программного обеспечения. Материалы обрабатывали статистически с расчeтом средних арифметических величин и их ошибок, вычислением индекса жизнеспособности лейкоцитов и определением достоверности различий по t-критерию Стьюдента. Результаты исследования. У всех пациентов 1й группы наблюдения жизнеспособность клеток оставалась высокой (ИЖ=0,41?0,05) с сохранением энергообеспечивающей функции митохондрий (величина флюоресценции митохондрий составила 120,20?4,18 отн.ед.). У пациентов 2й и 3й групп наблюдения все лейкоциты оказались погибшими с разрушенными митохондриями, ввиду чего не представляется возможным определить величины флюоресценции митохондрий и индекса жизнеспособности. У пациента 4й группы наблюдения обнаружили начальные признаки разрушения лейкоцитов с нарушением энергообразующей функции митохондрий (величина флюоресценции составила 113,15?2,12 отн.ед, p<0,05 в сравнении с пациентами 1й группы). У пациентов 5 группы при введении цитофлавина в пробу с лейкоцитарной взвесью наблюдалось два варианта изменения жизнеспособности клеток: у 80% больных увеличение жизнеспособности лейкоцитов (ИЖ повысился с 0,02?0,01 до 0,62?0,02, p<0,001) и у 20% - уменьшение данного показателя (ИЖ снизился с -0,13?0,01 до -0,60?0,03 р=0,09), при этом величина флюоресценции митохондрий изменялась в обоих случаях в сторону увеличения, но без достижения достоверности различий; морфологически лейкоциты на фоне введения цитофлавина не изменялись, соответствовали норме. Заключение. Исследования лейкоцитов крови человека следует проводить при соблюдении всех необходимых условий забора крови (в вакуумную пробирку утром натощак), отбора лейкоцитарной суспензии (с добавлением питательной среды исключительно в асептических условиях), их культивирования (в СО2 инкубаторе с 5%-ым содержанием углекислого газа) и анализа (в один день забора крови). Несоблюдение любой из указанных технических процедур сопровождается нарушениями функций митохондрий с последующей их деструкцией и гибелью лейкоцитов. По данным исследования in vitro препарат метаболического ряда цитофлавин у пациентов с ишемической болезнью сердца в 80% случаев способствует улучшению жизнеспособности клеток.

Ключевые слова
лейкоциты, жизнеспособность, ишемическая болезнь сердца, пациенты, микроскопия, цитофлавин, исследование in vitro

(статья в формате PDF. Для просмотра необходим Adobe Acrobat Reader)

открыть статью в

новом окне

Список литературы

1. Степанова, Е. С. Влияние переохлаждения на функциональную активность лейкоцитов /Е.С. Степанова: диссертация ... к. б. н., 2010. - 125с.

2. Воробьева, О. В. Апоптоз и некроз лимфоцитов периферической крови у недоношенных новорожденных с некротизирующим энтероколитом и бактериальной инфекцией /О.В. Воробьева //Запорожский медицинский журнал. - 2008. - Т.2, N1. - С.34-36.

3. ГОСТ Р 53079.4-2008. Национальный стандарт Российской Федерации. Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа. - Режим доступа: http://docs.cntd.ru/document/1200072566, свободный.

4. Козлов, В.А. Иммунная система и физические нагрузки /В.А. Козлов, О.Т. Кудаева // Медицинская иммунология. - 2002. - Т. 4, N 3. - С. 427-438.

5. Ливанов, Г.А. Сравнительная оценка влияния налоксона и метаболического антигипоксанта цитофлавина на клиническое течение и динамику показателей кислородотранспортных систем у больных с острыми тяжелыми отравлениями метадоном /Г.А. Ливанов, А.Т. Лоладзе, А.Н. Лодягин, Б. В. Батоцыренов, Д. В. Баранов // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2017. - Т.80, N6. - С.30-33.

6. Кузнецова, Е.А. Индукция редко- и плотноионизирущими излучениями повреждений ДНК в лейкоцитах крови и цитогенетических повреждений в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей и их потомков /Е.А. Кузнецова, С.И. Заичкина, Н.П. Сирота, С.А. Абдуллаев, О.М. Розанова, Г.Ф. Аптикаева, С.С. Сорокина, С.П. Романченко, Е.Н. Смирнова //Радиационная биология. Радиоэкология. - 2014. - Т.54, N4. - С.341-349.

7. Brubaker, L.H. Neutrophil life span in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria /L.H. Brubaker, L.J. Essig, C.E. Mengel //Blood. - 1977. - Vol.50. - P.657-662.

8. Головкин, А.С. Современные методы и подходы к изучению апоптоза в экспериментальной биологии /А.С.Головкин, А.В. Зурочка, С.В. Хайдуков, И.В. Кудрявцев // Медицинская иммунология. - 2012. - Т. 14, ? 6. - С. 461-482.

9. Бибикова, М.В. Олигомицины SCII и В подавляют пролиферацию и вызывают гибель клеток лимфолейкоза P388 и штамма, устойчивого к винкристину /М.В. Бибикова, Н.Э. Грамматикова, А.В. Катлинский, А.Ф. Корыстова, Л.Н. Кублик, М.Х. Левитман, В.В. Шапошникова, Ю.Н. Корыстов // Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии. - 2015. - Т. 32,N 2. - С. 135.

10. Ларионов, П.М. Изменение спектра лазерно-индуцированной флуоресценции ткани миокарда по мере снижения ее жизнеспособности /П.М. Ларионов, А.Н. Малов, М.М. Мандрик, Н.А. Маслов, А.М. Оришич //Журнал прикладной спектроскопии. - 2003. - Т. 70, N 1. - С. 38-42.

11. Ромащенко, О.В. Способ определения индивидуальной реактивности митохондрий человека под действием препаратов метаболического ряда в пробах in vitro /О.В. Ромащенко // Патент РФ ?2578436. - 2016.

12. Ginsberg, M.D. New Strategies to Prevent Neural Damage from Ischemic Stroke / M.D. Ginsberg. - 1994. - 34 p.

13. Микаелян, Н.П. Аденозинтрифосфат крови и активность инсулиновых рецепторов при сахарном диабете у детей /Н.П. Микаелян, А.Е. Гурина, А.В. Микаелян // Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке». - 2011. - Т.13, N3. - С. 369.

14. Vileno, B. Evidence of lipid peroxidation and protein phosphorylation in cells upon oxidative stress photo-generated by fullerols / B. Vileno, S. Jeney, A. Sienkiewicz, еt al.// Biophys. Chem. - 2010. - Vol.152 (1-3). - P.164-169.

15. Балаболкин, М.И. Роль гликирования белков, окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений при сахарном диабете / М.И. Балаболкин // Сахарный диабет. - 2002. - N4. - С.5-16.

16. Конторщикова, К.Н. Перекисное окисление липидов в норме и патологии / К.Н. Конторщикова. - Н. Новгород, 2000. - 23 с.

17. Балаболкин, М.И. Лечение сахарного диабета и его осложнений / М.И. Балаболкин, Е.М. Клебанова, В.М. Креминская: руководство для врачей. - М.: Медицина, 2005. - 512 с.

18. Титов, В.Н. Регуляция перекисного окисления in vivo как этапа воспаления. Олеиновая кислота, захватчики активных форм кислорода и антиоксиданты / В.Н. Титов, Д.М. Лисицын // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - N6. - С.3?12.

19. Губский, Ю.И. Токсикологические последствия окислительной модификации белков при различных патологических состояниях (обзор литературы) / Ю.И. Губский, И.Ф. Беленичев, Е.Л. Левицкий, С.И. Коваленко, С.В. Павлов, О.В. Ганчева, А.Н. Марченко // Журнал АМН Украiни. - 2008. - Т.814, N7. - С.49?54.

20. Рощупкин, Д.И. Основы фотобиофизики / Д.И. Рощупкин, В.Г. Артюхов. - Воронеж: ВГУ, 1997. - 116 c.

21. Артюхов, В.Г. Пути реализации апоптоза лимфоцитов человека, индуцированного УФ-светом и активными формами кислорода / В.Г. Артюхов, М.С. Трубицына, М.А. Наквасина, Е.В. Соловьева, О.В. Лидохова // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2011. - Т.51, N4. - С. 425-443.

22. Шмелeва, Е.В. Иммунокомпетентные клетки как мишень для терапии хронического гепатита С / Е.В. Шмелeва, Н.Д. Ющук, О.Ф. Ерeмина, И.П. Балмасова, Е.С. Малова, О.С. Нагаева // Лечащий врач. - 2011. - N 4. - С. 62.

23. Fedotcheva, N.I. Toxic effects of microbial phenolic acids on the functions of mitochondria / N.I. Fedotcheva, R.E. Kazakov, M.N. Kondrashova, N.V. Beloborodova // Toxicol. Lett. - 2008. - Vol. 180. - Р. 182-188.

24. Kayser, B. Lactate during exercise at high altitude / B. Kayser // Eur. J. Appl. Physiol. - 1996. -Vol. 74, No3. - P. 195-205.

25. Кашуро, В.А. Некоторые механизмы нарушения биоэнергетики и оптимизация подходов к их фармакотерапии / В.А. Кашуро, В.Б. Долго-Сабуров, В.А. Башарин, Е.Ю. Бонитенко, Н.В. Лапина // WWW.MEDLINE.RU. - 2010. - Т.11. (ФАРМАКОЛОГИЯ) - С.611-634.

26. Аксенцев, С.Л. Кальций, освобождаемый из внутриклеточных депо, ингибирует окислительное фосфорилирование митохондрий в синаптосомах мозга крыс при ацидозе / С.Л. Аксенцев, А.В. Левко, C.B. Федорович, С.Н. Орлов и др. // Биофизика. - 1998. - Т. 43, Вып. 2. - С. 315-318.

27. Румянцев, А. Г. Клиническая трансфузиология/А. Г. Румянцев, О. А. Аграненко.? М.: ГЭОТАР «Медицина», 1998. 575 с.

28. Craig, N. Regulation of translation in rabbit reticulocytes and mouse L-cells; comparison of the effects of temperature / N. Craig // J. Cell Physiol.- 1975.- Vol.87, N2.- P. 157-166.

29. Сведенцов, Е.П. Сохранение лейкоцитов в условиях околонулевых температур / Е.П. Сведенцов, О.О. Зайцева, Д.С. Лаптев, О.Н. Соломина, А.Н. Худяков, Т.В. Полежаева // Физиология человека. - 2010. - N3. - С.130-134.

30. Белоус, А.М. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении / А.М. Белоус, В.А. Бондаренко. Киев: Наукова думка, 1982. - 256 с.

31. Мовшев, Б.Е. Трансфузионные среды: перспективы / Б.Е. Мовшев, В.М. Витвицкий, И.Л. Лисовская, Ф.И. Атауллаханов // Новое в трансфузиологии. - 2001. - N28. - С. 38.

32. Румянцев, А.Г. Клиническая трансфузиология / А.Г. Румянцев, О.А. Аграненко. - М.: ГЭОТАР Медиа, 1998. - 575 с.

33. Фуллер, Б. Охлаждение, криоконсервирование и экспрессия генов в клетках млекопитающих / Б. Фуллер, К. Грин, В. И. Грищенко // Проблемы криобиологии. - 2004. - N3. - С. 58-71.

34. Liu, A.Y. Transient cold shock induces the heat shock response upon recovery at 37 degrees C in human cells / A.Y. Liu, H. Bian, L.E. Huang, Y.K. Lee // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269, N20.- P. 14768-14775.

35. Laios, E. Characterization of coldinduced heat shock protein expression in neonatal rat cardiomyocytes / E. Laios, I.M. Rebeyka, C. Prody // Mol. Cell. Biochem.- 1997.- Vol.173, N1-2.- P. 153-159.

36. Ромащенко, О.В. Влияние цитофлавина на ДНК лейкоцитов крови пациентов с ишемической болезнью сердца в зависимости от наличия полиморфизма гена эндотелиальной синтазы окиси азота/ О.В. Ромащенко // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2018. - Т.81, N6. - С.14-19.

37. Ромащенко, О.В. Влияние цитофлавина на апоптоз лейкоцитов крови пациентов с ишемической болезнью сердца в зависимости от носительства полиморфизма гена цитохрома CYP 2C9 в условиях in vitro/ О.В. Ромащенко // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2019. - Т.82, N1. - С.16-21.