Исследование дисперсий фосфолипидов. 1. Меченый NBD-PE и Rh-PE пальмитоилолеоилфосфатидилхолин Medline.ru - медико-биологический информационный портал Медлайн.ру

Исследование дисперсий фосфолипидов. 1. Меченый NBD-PE и Rh-PE пальмитоилолеоилфосфатидилхолин

Топалы В.П., Топалы Э.Е.

Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН

Резюме
Исследованы полученные методом упаривания обращeнной фазы экструдированные водные дисперсии меченого NBD-PE и Rh-PE в молярном отношении 1:1 пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (POPC). С ростом концентрации POPC флюоресценция дисперсии как при 530 нм (максимум эмиссии NBD-PE), так и при 577 нм (максимум эмиссии Rh-PE) при облучении фотонами 470 нм (максимум поглощения NBD-PE), монотонно возрастает. Это указывает на то, что перенос энергии от донора к акцептору осуществляется не по Фeрстеру и метод резонансного переноса энергии (РПЭ) неприменим для исследования дисперсий амфифилов. Флюоресценция дисперсий флуктуирует и уменьшается во времени. При длительном хранении (до 4 месяцев) маточной дисперсии в темноте при 25 ?С флюоресценция также достоверно уменьшается.Эти факты не удаeтся понять в рамках представления, будто исследованные дисперсии состоят из одноламеллярных липосом. В присутствии высоких концентраций детергента (выше ККМ - критической концентрации мицеллообразования) флюоресценция (F(Д)) резко возрастает с содержанием POPC в дисперсии. Значения F(Д) дисперсий с одинаковыми концентрациями красителей, но разными концентрациями POPC не удаeтся сколько-нибудь сблизить даже при длительном (до 7 суток) непрерывном перемешивании при температуре 25 ?С или при продолжительном (до 1 часа) облучении ультразвуком. Эта картина наблюдается с любым из использованных прежде для определения максимальной флюоресценции дисперсии (Fmax) детергентом (додецилсульфатом натрия, цетилтриметиламмоний бромидом, Тритоном Х100, восстановленным Тритоном Х-100), а также с дигептилфосфатидилхолином. Эти факты демонстрируют, что необходимый для анализа результатов исследования липидных дисперсий методом резонансного переноса энергии (РПЭ) параметр Fmax невозможно определить с помощью детергентов. Кроме того, они показывают, что современные модели дисперсий детергентов неверны. Ошибочно представление, будто существует некоторая номинальная концентрация (ККМ), ниже которой детергент диспергирован до молекул, а выше до мицелл Неверно также и представление будто при внесении в липидную дисперсию детергента до концентраций выше ККМ образуются смешанные детергентно-липидные мицеллы. Метод РПЭ для исследования слияния липосом и детергенты (цетилтриметиламмоний бромид и Тритон Х-100) для измерения Fmax рекомендуются Методами энзимологии (Hoekstra D., Düzgüneş N.. Lipid mixing assays to determine fusion in liposome systems. Methods in Enzymology, v. 220, part A, p. 15-32, 1993), что является загадкой. Все приведeнные в статье факты объясняются в рамках предлагаемой нами обобщeнной модели дисперсий амфифилов. Модель и интерпретация описанных в статье фактов излагаются в следующих двух статьях этой серии.

Ключевые слова
липидная дисперсия; флюоресцентные метки; резонансный перенос энергии; детергенты; мицеллообразование; смешанные детергентно-липидные мицеллы.

(статья в формате PDF. Для просмотра необходим Adobe Acrobat Reader)

открыть статью в

новом окне

Список литературы

1.Топалы В.П., Исследование дисперсий фосфолипидов.

2. Модель дисперсии амфифилов. Medline.Ru, 2006, (следующая статья 2), том 7, стр. 135-156

3.Топалы В.П., Топалы Э.Е. Исследование дисперсий фосфолипидов. 3. Экспериментальная проверка модели дисперсии липидов. Medline.Ru, 2006, (следующая статья 3) том 7, стр. 157-185

4.Bangham A.D., Standish M.M.,Watkins J.C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen Phospholipids. J.Mol. Biol., 1965, august, v. 13, n. 1, p. 238-252

5.Batzri S., Korn E.D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v. 298, n. 4, p. 1015-1019 6.Deamer D., Bangham A.D. Large Volume Liposomes by an Ether Vaporization Method. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 443, n. 3, p. 629-634

7.Enoch G., Strittmatter P. Formation and properties of 1000-Å-diameter, single bilayer phospholipid vesicles. PNAS USA,1979, v. 76, n. 1, p. 145-149

8.Fung K.-K., Stryer L. Surface density determination in membranes by fluorescence energy transfer. Biochemistry, 1978, v. 17, n. 24, p. 5241-5248

9.Hoekstra D., Düzgüneş N. Lipid mixing assays to determine fusion in liposome systems. Methods in Enzymology, v. 220, part A, p. 15-32, 1993

10.Huang C. Studies on Phosphatidylcholine Vesicles. Formation and Physical Characteristics. Biochemistry, 1969, v. 8, n. 1, january, p. 344-351

11.King R. G., Marchbanks R M. The incorporation of solubilized choline-transport activity into liposomes. Biochem J., 1982, v. 204, n.2, p. 565-576.

12.Lasic D.D. The mechanism of vesicle formation. Biochem. J. (1988) v. 256, n. 1, p. 1-11 Larrabee A. L. Time-dependent changes in the size distribution of distearoylphosphatidylcholine vesicles. Biochemitry, 1979, v. 18, n. 15, p. 3321-3326

13.Lentz B.R., Carpenter T.J., Alford D.R. Spontaneous Fusion of Phosphatidylcholine Small Unilamellar Vesicles in the Fluid Phase. Biochemistry, 1987, v. 26, n. 17, p. 5389-5397

14.Lichtenberg D., Freire E., Schmidt C.F., Barenholz Y., Felgner P.L., Thompson T.E. Effect of surface curvature on stability, thermodynamic behavior, and osmotic activity of dipalmitoylphosphatidylcholine single lamellar vesicles. Biochemistry, 1981, v. 20, n.12, p. 3462-3467

15.Miyamoto V.K., Stoeckenius W. Preparation and Characteristics of Lipid Vesicles. J. Membrane Biol. 4, 252-269 (1971)

16.Reynolds J.A. The role of micelles in protein-detergent interactions. Methods in Enzymology, v. 61, part H, p. 58-62, 1979 17.Riquelme G., Lopez E., Garcia-Segura L.M., Ferragut J.A., Gonzalez-Ros J.M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochemistry, 1990, v. 29, n. 51, p. 11215 - 11222

18.Struck D. K., Hoekstra D., Pagano R. E. Use of resonance energy transfer to monitor membrane fusion. Biochemistry, 1981, v. 20, n. 7, p. 4093-9. Stryer L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Ann.Rev.Biochem., 1978, v. 47, p. 819-846

19.Szoka F., Jacobson K., Derzko Z., Papahadjopoulos D. Fluorescence studies on the mechanism of liposome-cell interactions in vitro. BBA, 1980, july, v. 600, n. 1, p. 1-18

20.Uster P.S., Deamer D.W. Fusion competence of phosphatidylserine-containing liposomes quantitatively measured by a fluorescence resonance energy transfer assay. Arch.Bioch.Bioph., 1981, july, v.209, n.2, p.385-395

21.M. P. Viola-Magni, P. B. Gahan, E. Albi, R. Iapoce, P. F. Gentilucci. Phospholipids in chromatin: incorporation of [32P]O42- in different subsellular fractions of hepatocytes. Cell Biochemistry and Function, v. 4, p. 283-288, 1986.