Особенности проявлений токсического действия норборнана

Норборнан (НБ) [2.2-ди(трифторметил)-3,3-дициано-5,6 дихлорнорборнан] относится к ГАМК-литикам, блокирующим хлор-ионофоры ГАМКа- рецепторов [3, 4, 5, 6]. Впервые синтезирован в 1982 году Мидлтоном, поэтому яд иногда называют веществом (эфиром) Мидлтона [2]. Препарат проявляет высокую физиологическую активность у млекопитающих, ЛД50 для грызунов составляет 100-120 мкг/кг массы тела. Токсичность норборнана мало зависит от вида аппликации (перорально, подкожно, внутримышечно). ГАМК-литики, обладающие способностью ингибировать хлор-ионные каналы, занимают особое место среди физиологически активных веществ [3, 4, 5, 9, 11]. В эту группу включают пикротоксин (ПТ), тетраметилендисульфотетрамин, TETS (в России чаще пользуются термином дисульфотетраазаадамантан - ДСТА), 2,6,7-триоксабицикло[2.2.2]октаны (бициклофосфаты, бициклофосфоротионаты, бициклоортобензоаты, бициклоортокарбоксилаты), норборнаны, некоторые фармакологические препараты и другие вещества [3, 4, 5, 9, 11]. Исследования свойств ГАМК-литиков приобретают все большее фундаментальное значение. Данные вещества незаменимы при изучении не только морфо-функциональных особенностей ГАМК/бензодиазепин/рецепторного комплекса но и для проведения работ по оценке степени участия различных нейромедиаторных систем в регуляции физиологических функций организма, а также при оценке фармакологической активности противосудорожных средств, снотворных, транквилизаторов и других нейроактивных препаратов [5, 9, 11, 13]. Следовательно, ГАМК-литики представляют несомненную ценность для дальнейшего прогресса различных направлений современной медицины: нейрофармакологии, психиатрии, невропатологии и т. д. В данной работе рассматриваются некоторые аспекты физиологической активности норборнана. Основными ферментными системами, участвующими в биотрансформациии ксенобиотиков в организме млекопитающих являются неспецифические монооксигеназные системы (НМОГС). С целью выяснения их роли в метаболических превращениях норборнана нами был использован ингибитор НМОГС - хлористый кобальт. Как оказалось, токсичность норборнана для грызунов в этих условиях изменялась мало (табл. 1). Полученный факт не позволяет сделать окончательное заключение о решающей роли НМОГС в метаболизме норборнана. Таблица 1 Токсичность норборнана для белых мышей на фоне предварительного (за 2 часа) введения хлорида кобальта (15 мг/кг) [5]. Вещество ЛД50 в различные сроки после введения норборнана Через 1 сутки Через 2 суток Через 4 суток Норборнан 0,229+/-0,019 0,201+/-0,015 0,197+/-0,014 СоСl2+ норборнан 0,238+/-0,019 0,238+/-0,019 0,238+/-0,019 Примечание: токсичность определяли с использованием пробит-анализа; время наблюдения - 4 суток. Как известно, в нейтрализации многих токсикантов определенное участие принимают карбоксилэстеразы и сывороточный альбумин крови [1, 7, 16]. Для оценки значения данных белков в детоксикации норборнана использовали салицилаты блокирующие гидрофобные зоны сывороточного альбумина и тормозящие его синтез [7, 17] и триортокрезилфосфат (ТОКФ) - необратимый ингибитор карбоксилэстераз [16]. Установлено, что в условиях предварительного введения ингибиторов сывороточного альбумина и карбоксилэстераз токсичность норборнана для мышей достоверно повышалась [4, 5]. Что свидетельствует о существенной роли названных белков в токсикокинетических процессах при интоксикации норборнаном. Клиническая картина отравлений норборнаном несколько отличается от интоксикации "классическими" блокаторами хлор-ионных каналов. Так, судорожная активность развивается через десятки минут - часы после введения норборнана (пикротоксин, 2, 6, 7-триоксабицикло[2. 2. 2.]октаны и ДСТА вызывают судороги через несколько минут). Соответственно, гибель отравленных животных наступает через несколько часов или даже суток. Процесс восстановления после воздействия норборнаном затягивается на несколько недель. Нередко на 2 - 3 сутки от начала интоксикации норборнаном в минимальных смертельных дозах у крыс развивается спонтанная агрессивность [3]. Это позволяет считать норборнан перспективным средством для создания экспериментальных моделей при изучении агрессивности. Установлено, что в формирование сдвигов спонтанного поведения у крыс, отравленных норборнаном, вовлечены, помимо ГАМКа-ергических, и другие нейромедиаторные системы головного мозга [8]. По-видимому, модификация активности сопряженных медиаторных систем представляет перспективное направление поиска эффективных средств терапии несмертельных отравлений норборнаном. Воздействие норборнаном сопровождается и другими изменениями поведения экспериментальных животных: нарушаются процессы обучения и формирования памяти, мышечная координация, локомоторная активность [3]. Норборнан вызывает сдвиги пищевого и питьевого поведения [8]. Вероятно, перечисленные свойства яда могут быть использованы специалистами, изучающими патологические формы поведения. В наших экспериментах удалось показать, что однократное предварительное введение норборнана в минимально смертельных дозах сопровождается повышением чувствительности белых мышей к другим судорожным ядам: пикротоксину (ингибитор хлор-ионных каналов ГАМКа-рецепторов), бикукуллину (блокатор низкоаффинных ГАМКа-рецепторов), 3-меркаптопропионовой кислоте (3-МРА) (тормозит синтез ГАМК в головном мозге), никотину (агонист Н-холинорецепторов). Повышенная судорожная готовность сохраняется несколько суток с момента однократного введения норборнана (табл. 2). Таблица 2 Токсичность ГАМК-литиков - ПТ и 3-МРА (в % к контролю) для белых мышей в различные сроки после однократного введения норборнана в дозе 0,095 мг/кг (ЛД16). Условия Токсичность 3-МРА (контроль) 100% НБ+ 3-МРА через 1 час 108% через 24 часа 218% через 48 часов 96% ПТ (контроль) 100% НБ+ ПТ через 1 час 271% через 24 часа 336% через 48 часов 156% Примечание: ЛД50 для 3-МРА и пикротоксина в контроле составила 29,4 +/- 2,5 мг/кг и 11,1 +/- 1,6 мг/кг, соответственно. Это позволяет заключить, что норборнан может найти применение при изучении механизмов судорожной активности, а также для оценки эффективности противосудорожных средств. Несомненное преимущество яда перед другими судорожными агентами, используемыми для формирования киндлинга, состоит в том, что повышенная судорожная готовность развивается после однократного введения норборнана. "Классический" киндлинг, например с использованием пикротоксина, развивается после многократных ежедневных инъекций токсоагента. Следовательно, применение норборнана в таких исследованиях дает определенный экономический эффект. Следует ожидать, что норборнан может найти применение при изучении механизмов судорожной активности, а также при оценке эффективности противосудорожных средств. Полученные результаты позволяют предположить, что причиной необычной физиологической активности норборнана может быть особый характер его взаимодействия с рецепторами - мишенями в головном мозге. Ранее нами продемонстрирована способность норборнана к высокоаффинному взаимодействию с хлор-ионными каналами центральных ГАМКа - рецепторов [6]. Использование необратимых лигандов хлор-ионных каналов в нейрохимических исследованиях, по мнению рядов авторов, ускорит процесс изучения структуры и функции ГАМК-рецепторного комплекса, в частности, ионофора [5, 6, 10, 13, 14]. Остаются невыясненными места связывания этих агентов: внутри канала или за его пределами. Точно также отсутствуют четкие данные, с какой именно субъединицей (субъединицами) рецептора происходит их взаимодействие. Полагают, что ковалентная связь с белком возникает с участием аминогруппы аминокислоты (аминокислот) [14]. Возможно, эти рассуждения справедливы и в отношении норборнана. В следующей серии экспериментов ex vivo установлено, что при системном введении норборнана выявлялось необратимое угнетение хлор-ионных каналов в целом мозге мышей тестируемых с помощью меченного тритием третбутилбициклоортобензоата (3Н - ТВОВ) (табл 3). Таблица 3 Влияние норборнана и пикротоксина на связывание 3Н - ТВОВ (5 нМ) с мембранами целого мозга мышей (без мозжечка). Опыты ex vivo [5]. Доза норборнана, мг / кг Доза пикротоксина, мг / кг 0,1 0,4 0,5 0,5 1,0 2,0 Связывание лиганда, % от нормы 72 + 12 * 51 + 10 * 27 + 13 ** 96 +12 101 + 8 103 + 10 Примечания: * - Р<0, 01; ** - Р<0, 001 в сравнении с контролем. Яды вводили внутрибрюшинно. Животных умерщвляли через 30 мин. При дозах норборнана 0,4 - 0,5 мг / кг и пикротоксина 2 мг / кг у отдельных животных отмечались судороги 4 степени. Связывание лиганда в контроле составило 144 +/- 11 фМ / мг белка. Уменьшение плотности ионофоров (оценивалось по связыванию 3Н - ТВОВ с отмытыми синаптическими мембранами целого мозга мышей) отмечалось после введения норборнана в дозе 0,1 мг/кг, не вызывающей судорог в период исследования (30 мин). При введении яда в дозах 0,4 - 0,5 мг/кг у отдельных мышей развивалась судорожная активность 4-й степени (повторные приступы клонико-тонических судорог с падением животного на бок). При этом плотность хлор-ионных каналов была снижена на 49 % (доза 0,4 мг/кг) и 73 % (доза 0,5 мг/кг). Полученный факт соответствует современным представлениям о том, что судороги при интоксикации ГАМК-литиками развиваются после блокады не менее половины хлорионофоров в центральной нервной системе [9, 15]. При введении пикротоксина в эквитоксических дозах изменений специфического связывания 3Н - ТВОВ не выявлено. Полученные данные свидетельствуют, что норборнан необратимо ингибирует рецепторы - мишени как in vitro, так и in vivo. Данное свойство яда может привлечь внимание нейрохимиков, занимающихся изучением молекулярной структуры ГАМК/бензодиазепин/ионофорного комплекса. ВЫВОДЫ Таким образом, судорожный агент норборнан обладает необычной биологической активностью в сравнении с "классическими" ГАМК-литиками пикротоксином t-бутилбициклофосфатом, тетраметилендисульфотетрамином. 1. НМОГС не играет существенной роли в метаболизме норборнана. 2. Карбоксилэстеразы и сывороточный альбумин крови играют существенную роль в токсикокинетических процессах при интоксикации норборнаном. 3. Однократное предварительное введение норборнана в минимально смертельных дозах сопровождается повышением чувствительности белых мышей к другим судорожным ядам. 4. Норборнан необратимо ингибирует рецепторы - мишени как in vitro, так и in vivo. 5. Выявленные свойства яда могут быть использованы при изучении патологических форм поведения, судорожной активности, агрессивности и нейрохимических механизмов функционирования центральных ГАМК-рецепторных систем.

Список литературы

1.Абдувахабов А. А. , Михайлов С. С. , Садыков А. С. , Щербак И. Г. Антиферментное действие фосфорорганических ингибиторов холинэстераз. - Ташкент.Фан,1989. - 182 с.





2. Антонов Н.С. Химическое оружие на рубеже двух столетий. -М.: А/О "Прогресс", 1994. - 174 с.





3. Гладких В.Д., Колосова Н.А., Лошадкин Н.А. Особенности токсического действия ГАМК- антагонистов "клеточной" структуры норборнанового ряда / Токсикол. вестник. - 1995. -N2. -с. 10-13.





4. Гладких В.Д., Колосова Н.А., Лошадкин Н.А. Эффекты совместного действия "бициклогептана" с другими физиологически активными веществами / Токсикол. вестник. -1995. -N6. -С 12-16.





5. Головко А.И., Головко С.И., Зефиров С.И., Софронов Г.А. Токсикология ГАМК-литиков. -Спб. : Нива, 1996. -144с.





6. Головко А.И., Софронов Г.А., Клюнтина Т.В. Норборнан - новый необратимый лигант хлорионных ГАМКа - рецепторов / Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1996. -N4. -С. 444-446.





7. Луйк А.И., Лукьянчук В.Д. Сывороточный альбумин и биотранспорт ядов. -М.: Медицина, 1984. -224 с.





8. Свидерский О.А., Головко А.И., Иванов М.Б., Софронов Г.А. Изменение пищевого (питьевого) поведения крыс при интоксикации норборнаном/ Сборник III-го Российского национального конгресса "Человек и лекарство".-М., 1996.-С.285.





9. Casida J.E., Nicholso R.A., Palmer C. J. Trioxabicyclooctanes as probes for the convulsant site of the GABA-gated chloride channel in mammals arthropods / Neurotox 88 : Mol . Basis Drung and Pestig. Act. -Amsterdam etc., 1988. - P. 125-144.





10. de Costa B.R., Lewin A.H., Rice K.C. et al. Novel site - directed affinity ligands for GABA - gated chloride channels: synthesis, characterization, and molecular mjdeling of 1 - ( isothiocyanatopheny ) - 4- tert-butyl-2,3,7 trioxabicyclo [ 2,2,2 ] octanes / Y. Med. Chem. -1991. Vol. 34. N34, -P. 1531-1538.





11. Farrant M., Webster R.F. GABA antagonists: Their use and mehanisms of action /Drugs as Tools Neurotransmitter Res. - Clifton ( N.J. ), 1989. -P. 161-201.





12. Ferri G. Clonet: the key to atranguil brain. the discjvtry of the structure of one brain' s molecular switches is a feather in the cap of British molecular biologists /New Sci. -1987. -Vol. 115, N 1572. -P. 26-27.





13. Lewin A.H., de Costa B.R., Rice K.C., Skolnick P. meta-and para-Isothiocyanato-t-butylbicycloorthobenzoate: Irreversible ligands of the -aminobutyric acid-regullated chloride ionjphore /Mol. Pharmacol. -1989. -Vol. 35, N2. -P. 189-194.





14. Moody E.J., Lewin A.H., de Costa B.R. et al. Site-specific acylation of GABA-gated Cl-- uptake /Eur. J. Pharmacol. -1991. -Vol. 206, N2. -P. 113-118.





15. Palmer C.J., Cole L.M., Casida J.E. ( + ) -4 -tert-Buty13-cyano-1-( 4-ethynylphenyl )-2,6,7-trioxabi-cyclo [ 2.2.2 ] octane: Synthesis of a remarkably potent GABAa receptor antagonist / J. Med. Chem. -1988. -Vol. 31, N6. -P. 1064-1066.





16. Russel R.W., Overstreet D.H. Mechanisms underlying sensitivity to organohosphorus anticholinesterase compounds // Prog. Neurobiol. - 1987. -Vol. 28, N 2. -P. 97-129.





17. Teraki Y., Maemura S. Histotoxicity and minerali metabolism of chelating agent in rats // Eur. J. Pharmacol. -1990. - Vol. 183, N 6. -P. -2453.