Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Эксперимент проведен на 28 крысах-самцах линии <Wistar> массой 200-210 г. Все животные были распределены на 4 группы (n = 7): контрольная, в которой перфторан не вводился, и 3 опытные, в которых перфторан вводился однократно из расчета 5 мл/кг массы. Кровь для исследования забирали посредством пункции яремного синуса через 24, 72, и 168 часов после введения перфторана. Пробы крови выдерживались 24 часа при температуре +2-+4? С в закрытой посуде.
Состояние свободно-радикального окисления липидов оценивали по уровню малонового диальдегида (МДА), диеновых конъюгатов (ДК) и шиффовых оснований (ШО) в мембране эритроцитов по методикам (1, 2). Содержание внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) в плазме крови определяли стандартным гемоглобинцианидным способом с помощью наборов <Реанал> (Венгрия) (4). Суммарную пероксидазную активность (СПА) в плазме крови определяли модифицированным методом (2). Для определения микровязкости мембран липиды экстрагировали из мембран методом (15). Мембраны выделяли по методу (6). Для оценки структурного состояния мембран эритроцитов определяли микровязкость липидной фазы [Fэ/Fм 334] и аннулярных липидов [Fэ/Fм 282]. Степень погружения белков в липидный бислой определяли по тушению флюоресценции белков пиреном - F0-F/F0, происходящему вследствие безизлучательного переноса энергии с триптофанилов мембранных белков на пирен при максимуме возбуждения 282 нм (1). Полярность окружения зонда пирена в мембране оценивали с помощью параметра F372/F393, равного отношению интенсивности флюоресценции пирена в суспензии эритроцитов при максимуме возбуждения 334 нм и длинах волн флюоресценции 372 и 393 нм. Для определения структурных параметров использовали суспензию эритроцитов, разведенную до оптической плотности 0,720 ед. при длине волны поглощения 650 нм. Конечная концентрация пирена составляла 8 мкМ. Определение активности супероксиддиссмутазы (СОД) в мембране эритроцита проводили по методу (16). Удаление гемоглобина из гемолизата и плазмы производили по методу (17). Определение активности каталазы в мембранах производили по методу (7).
Как показано в табл.1, плеторическое введение перфторана сопровождается умеренным повышением интенсивности процессов ПОЛ в мембранах эритроцитов.
Таблица 1. Интенсивность ПОЛ и активность ферментативной антиоксидантной системы мембран эритроцитов после однократного введения перфторана
| Показатели | Контроль | Сроки введения перфторана (часы) | ||
| 24 | 72 | 168 | ||
| ДК, нмоль/мгHb | 2,23±0,53 | 2,30±0,23* | 3,56±0,46** | 3,86±0,35** |
| МДА, нмоль/мгHb | 3,53±0,25 | 4,01±0,27* | 4,57±0,28** | 4,26±0,39* |
| ШО, ед.фл/ мгHb | 0,563±0,057 | 0,413±0,045** | 0,605±0,081* | 0,684±0,040** |
| СОД, ед/ мгHb | 2,92±0,16 | 2,49±0,13** | 2,61±0,19* | 3,31±0,55** |
| Каталаза, нмоль | 19,68±1,17 | 32,95±4,18** | 25,14±2,45** | 32,49±5,48** |
| Н2О2 / мгHb/мин | ||||
Примечание: * - p>0,05 по сравнению с контролем
**- р<0,05 по сравнению с контролем
Видно, что концентрация первичного продукта ПОЛ - ДК - превышала таковые в контрольной группе на 60-73% через 72-168 часов, вторичного продукта - МДА - на 29% через 72 часа. Содержание третичного продукта ПОЛ - ШО - имело разнонаправленную динамику с тенденцией к повышению только через 168 часов. При этом активность СОД оставалась практически неизменной, а активность каталазы превышала уровень таковой в контроле на 67%, 22% и 65% соответственно.
Концентрация ВЭГ и уровень СПА в плазме крови являются информативными и чувствительными показателями стабильности мембран. Их величины имели стойкую тенденцию к снижению, что согласуется с данными (3). Динамика изменения содержания ВЭГ и уровня СПА представлена на графике 1.
График 1. Содержание ВЭГ и уровень СПА в плазме крови
Структурно-функциональные свойства мембран эритроцитов исследовались с помощью флюоресцентного зонда пирена (таблица 2).
Таблица 2. Структурно-функциональные свойства мембран эритроцитов при однократном внутривенном введении перфторана
| Показатели | Контроль | Сроки введения перфторана (часы) | ||
| 24 | 72 | 168 | ||
| Fэ/Fм (334) | 0,53±0,03 | 0,47±0,06* | 0,47±0,06* | 0,64±0,03* |
| Fэ/Fм (282) | 0,91±0,09 | 0,71±0,03** | 0,53±0,04** | 0,56±0,06** |
| F0-F/F0 | 0,111±0,011 | 0,122±0,076* | 0,121±0,008** | 0,065±0,003** |
| F372/F393 (334) | 1,21±0,05 | 0,99±0,04** | 0,96±0,08** | 1,17±0,05* |
| F372/F393 (282) | 1,79±0,06 | 1,77±0,07* | 1,77±0,08* | 1,78±0,06* |
Примечание: * - p>0,05 по сравнению с контролем
** - р<0,05 по сравнению с контролем
Показано, что
коэффициент эксимеризации пирена Fэ/Fм (334),
характеризующий текучесть липидного слоя (микровязкость) мембран, достоверно не превышает аналогичные цифры в
контроле. Однако коэффициент эксимеризации пирена Fэ/Fм (282) имеет тенденцию к снижению в течение
всего времени исследования, что свидетельствует о повышении микровязкости зоны
аннулярных липидов, образующих микроокружение мембранных белков. Можно
предположить, что перфтордекалин, распределяясь в липидной фазе мембран, повышает
структурированность аннулярных липидов и вступает в неспецифическое
взаимодействие с мембранными белками, увеличивая функциональную активность
мембранных ферментов, рецепторов, ионных каналов (8,9,10,11).
Параметр F0-F/F0 , характеризующий эффективность
безизлучательного переноса энергии с триптофановых остатков мембранных белков
на пирен, имеет разнонаправленную динамику, несколько увеличивая свое значение
через 72 часа после введения перфторана и снижаясь на 37% через 168 часов по
сравнению с данными контрольной группы. Значения параметра F372/F393 (334) через 24 и 72 часа
увеличивались на 18% и 21% соответственно, что свидетельствует об уменьшении
полярности липидного слоя мембран эритроцитов; через 168 часов величина параметра не отличается
от контроля. Динамика значений полярности зоны аннулярных липидов не отличается
от таковой в контроле. Динамика показателей структурно-функционального
состояния мембран эритроцитов представлена на графике 2.
График 2. Динамика
изменения параметров структурно-функционального состояния мембран эритроцитов
после однократного внутривенного ведения перфторана.
Таким образом,
однократное плеторическое введение перфторана в дозе 5 мл/кг массы несколько
увеличивает интенсивность начальных стадий ПОЛ в мембранах эритроцитов,
повышает стабильность и оптимизирует структурно-функциональное состояние
мембран эритроцитов.
Список литературы
1. Владимиров Ю.А., Добрецова Г.В. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М., Наука, 1980. - 320 с.
2. Внуков В.В., Кричевская А.А., Лукаш А.И. Содержание гемоглобина, трансферинов и общего железа в сыворотке крови при гипероксии и защитном действии мочевины//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1979. - ? 6. - с.528-530.
3. Газимагомедова М.М. Структурно-функциональные изменения мембран эритроцитов при остром отравлении метафосом и их коррекция перфтораном//Автореферат дисс. к.б.н., Махачкала, 1999. - 21 с.
4. Колб В.Г., Камышников В.С. Справочник по клинической химии. Минск: Беларусь, 1982. - 256 с.
5. Колчинская Л.И., Лишко В.К., Малышева М.К. Изучение взаимодействия Na+, K+ - АТФ-азы эритроцитов с субаином, влияние ацетилфосфата//Био-химия. - 1976. - ? 3. - с. 933-938.
6. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майрова И.Г., Токарев В.Е. Метод определе-ния активности каталазы.//Лабораторное дело. - 1988. - ? 1. - с. 16-19.
7. Е.И.Маевский, О.Г.Аксенова, Л.А.Богданова, В.В.Мороз, Р.Я.Сенина, С.Ю.Пушкин, Г.Р.Иваницкий. Анализ побочных и клинических эффектов, выявленных в ходе 1 и 2 фаз клинических исследований перфторана // Вестник службы крови России. 2001, декабрь, ?4, с.23-20.
8. Михайлов Г.М., Варыханов А.А., Омарова Л.А. и др. влияние перфторуглеродной эмульсии - индуктора ферментов цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системы печени на острую токсичность ССl4 и на эффективность профилактического применения антдотов при интоксикации фосфорорганическими пестицидами//Фармакология и токсикология. - 1990. - ? 4. - с. 60-52.
9. Михайлов Г.М., Варыханов А.А., Веровский В.Е., Образцов В.В. Влияние эмульсии перфторана на систему биологической защиты организма//Перфторуглеродные активные среды для биологии и медицины. Пущино, 1993. - с. 141-144.
10. Образцов В.В. Кабальнов А.С., Гросс У и др. Взаимодействие эмульсии перфторуглеродов с микросомальными мембранами печени// Перфторуглеродные активные среды для биологии и медицины. Пущино, 1993. - с. 117-129.
11. Образцов В.В., Шехтман В.Б., Склифас А.Н. Разобщение монооксигеназной сис-те-мы печени перфторуглеродами//Биохимия. - 1994. - ? 8, с. 1175-1181.
12. В.П.Скулачев
13. Стальная И.Д., Горишвили Т.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты//Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977. - С. 66-68.
14. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных кислот//Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977. - С. 63-64.
15. Bligh E., Dyer W.J. Rapid method of total lipid extraction fnd purification//Can. Biochem. Physiol. - 1959. - v. 37. - ? 8. - p. 911- 912.
16. Fried R. Enzymatic and non-enzymatic assay of superoxide dismutase. //Biochemistry. - 1975. - v. 87. - P. 657-666. Minami M., Yoshikama H. A simplitied method of superoxide dismutase activity for clinical use//Clin. Chim. Acta. - 1979. - v. 92. - ? 3. - р. 337-342.
