Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Препарат разрешен в Российской Федерации для медицинского применения и промышленного выпуска (регистрационное удостоверение ? 96/50/10). Однако препарат не проходил специальной регистрации для применения в педиатрической практике, Для такого расширения сферы применения требуется провести дополнительные исследования, в том числе и по разделу доклинических испытаний
Целью исследований, результаты которых представлены в данной работе, явилось экспериментальное изучение общетоксического действия препарата перфторан на неполовозрелых животных.
1. Материалы и методы
На исследования был представлен препарат перфторан, производства ОАО НПФ "Перфторан", серия 470901, срок годности до 09.2004 г. Препарат представлен в замороженном виде во флаконах по 100 мл общим объемом 2 литра.
Исследования проведены в соответствии с "Методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ", изложенными в "Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ". М., ЗАО "ИИА "Ремедиум", 2000, с. 18-24.
?ксперименты проводили на неполовозрелых инбредных крысах, мышах и кроликах породы шиншилла, полученных из Центрального питомника лабораторных животных РАМН (отделение УКрюковоФ). Содержание животных соответствовало санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев), утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г. Кормили животных натуральными и брикетированными кормами в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР ?755 от 12.08.77 г. Животные прошли карантин и акклиматизацию в условиях вивария в течение 14 дней. ?кспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве определяющего показателя. При проведении экспериментов ежедневно наблюдали за общим состоянием животных, потреблением корма и воды; один раз в неделю определяли массу тела.
Клинические анализы крови крыс проводили по стандартным методикам. Биохимические показатели сыворотки крови определяли следующими унифицированными методами: общий белок - биуретовым, глюкозу - глюкозооксидазным, мочевину ‑ уреазным/фенол-гипохлорит-ным, креатинин ‑ методом яффе с депротеинизацией, холестерин ‑ энзиматическим колориметрическим методом, аспартат-аминотрансферазу (АсАТ) и аланинаминотрансферазу (АлАТ) ‑ унифицированным методом Райтмана-Френкеля, щелочную фосфатазу ‑ унифицированным методом с нитрофенилфосфатом, общий билирубин ‑ методом Ендрассика-Грофа (наборы реактивов фирмы УOlvex DiagnosticumФ, Россия).
При анализе мочи белок в пробах определяли по методу Лоури, глюкозу - модифицированным глюкозооксидазным методом, мочевины - с помощью унифицированного метода по цветной реакции с диацетилмонооксимом, используя стандартный набор реактивов АО "Реагент" (Днепропетровск). Концентрацию ионов натрия и калия измеряли с помощью ионселективных электродов методом калибровочных кривых. Полуколичественное определение содержания кетоновых тел, уробилиногена, билирубина и рН проводили в свежих образцах мочи с помощью индикаторных бумажных тестов производства фирмы "Lachema"(Чехия).
Кусочки органов животных фиксировали в 10%-ном растворе формалина, после стандартной проводки через спирты заливали парафином и приготавливали срезы толщиной 5-6 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и заключали в канадский бальзам. Анализ гистологических препаратов проводили под световым микроскопом.
Статистическую обработку результатов исследований проводили стандартными параметрическими методами.
Конкретные условия проведения отдельных экспериментов приве-дены в соответствующих разделах главы "Результаты исследований" 2. Результаты исследований 2.1. Результаты изучения острой токсичности перфторана
Острую токсичность перфторана определяли путем внутрибрюшинного введения аутбредным мышам. Использовали 2 группы мышей: с массой тела 12-14 г (неполовозрелые) и 22-24 г (взрослые). Каждой группе перфторан вводили в дозах 273, 182 или 91 мл/кг массы тела. В группу брали по 6 мышей. Каждую дозу препарата вводили за 6 приемов с интервалом 1 час, поскольку внутрибрюшинный способ введения имеет свои ограничения по объему однократно вводимой дозы.
При наблюдении в течение многократных введений препарата, мыши обеих групп не проявляли сколько-нибудь заметных признаков интоксикации. Через 24 часа после последнего введения, у мышей, как неполовозрелых, так и взрослых, получивших максимальную дозу препарата, отмечены признаки угнетения центральной нервной системы, отказ от корма и воды. К исходу вторых суток пало 4 взрослых мыши и 5 неполовозрелых, из числа получивших максимальную дозу, и 1 и 3 мыши соответственно из числа получивших среднюю дозу перфторана. В группах животных, получивших минимальную дозу перфторана, гибели не было, и у животных отсутствовали признаки интоксикации. При вскрытии трупов павших животных отмечены признаки нарушения гемодинамики в паренхиматозных органах.
Дальнейшее наблюдение за животными вели в течение 2 недель. При этом не было отмечено каких-либо патологических реакций, в том числе и у выживших после воздействия максимальной и средней доз перфторана.
По результатам острого эксперимента, средние летальные дозы (ЛД50) препарата перфторан, определенные методом пробитов, составили для взрослых мышей 239 мл/кг, для неполовозрелых ¾ 183 мл/кг. 2.2. Результаты изучения общетоксического действия перфторана при повторных многократных введениях
2.2.1. Результаты изучения общетоксического действия перфторана при трехкратном внутрибрюшинном введении неполовозрелым крысам
В данном эксперименте перфторан вводили неполовозрелым крысам внутрибрюшинно в дозе по 30 мл на кг массы тела в течение трех дней подряд. Животным контрольной группы внутрибрюшинно вводили 0,85%-ный раствор хлорида натрия. Лабораторные исследования проводили в три срока: через сутки после последнего введения перфторана, через две недели и через 1 месяц. В каждый срок исследованию подвергали по 8 животных каждой из групп.
При внутрибрюшинном введении перфторана не было отмечено каких-либо изменений клинического состояния животных как непосредственно после введения препарата, так и на протяжении всего периода наблюдения. Во все сроки наблюдения животные были активны, потребление корма и воды соответствовало физиологической норме, динамика массы тела также была положительной (таблица 1).
Таблица 1. Динамика массы тела белых крыс в эксперименте при трехкратном внутрибрюшинном введении перфторана
| Препарат, доза | Масса тела (г) в срок исследования | ||||
| Начальный вес | 1-я неделя | 2-я неделя | 3-я неделя | 4-я неделя | |
| САМЦЫ | |||||
| Перфторан, 30 мл/кг | 85,4±4,1 | 97,2±7,5 | 122,9±9,2 | 142,7±8,7 | 159,1±12,4 |
| Контроль | 87,3±4,0 | 107,5±8,2 | 128,7±6,2 | 145,3±9,6 | 164,3±10,4 |
| САМКИ | |||||
| Перфторан, 30 мл/кг | 82,3±2,6 | 98,2±6,1 | 117,4±5,6 | 134,8±4,0 | 145,0±7,5 |
| Контроль | 79,4±2,7 | 102,5±5,3 | 118,3±4,2 | 137,2±7,9 | 146,9±10,8 |
Результаты клинических лабораторных
исследований через сутки после последнего введения перфторана
Анализ показателей периферической крови
через сутки после последнего введения перфторана (суммарная доза 90 мл на кг)
не выявил изменений (таблицы 2 и 3).
При анализе биохимических показателей
сыворотки крови был обнаружен ряд изменений (таблицы 4 и 5). Так, у самцов крыс
достоверно увеличена концентрация глюкозы и снижена концентрация мочевины. У
самок достоверно увеличены концентрация глюкозы и креатинина, снижены
концентрация общего белка и мочевины, а также повышена активность щелочной
фосфатазы.
Биохимические показатели мочи крыс через
сутки после третьего введения перфторана не претерпевали изменений (таблицы 6 и
7).
При патологоанатомическом исследовании,
проведенном через сутки после последнего (третьего) введения перфторана крысам
(суммарная доза 90 мл на кг массы тела), у животных подопытной группы обращали на себя внимание измененные размеры
и внешний вид печени и селезенки. Печень была увеличена в размерах,
светло-коричневого цвета, капсула гладкая, напряженная, края органа притуплены,
паренхима на разрезе темноЦкрасная, полнокровная. Селезенка Ц увеличена в
размерах, капсула напряжена, пульпа темноЦвишневого цвета. Массовые
коэффициенты печени и селезенки крыс, получавших перфторан, имели статистически
значимые различия по сравнению с контролем как у самцов, так и у самок (таблица
8).
Таблица 2. Гематологические
показатели самцов крыс через 24 часа после трехкратного внутрибрюшинного
введения препарата перфторан, 30 мл/кг
Показатель, ед.
измерения
Препарат
Физ.р-р
Перфторан
Гемоглобин, ммоль/дм3
11,1±0,3
11,2±0,2
?ритроциты, млн/мм3
6,0±0,2
6,0±0,2
Гематокрит, %
45,9±1,2
43,5±0,9
Ср.объем эритр., мкм3
77,0±2,0
73,0±0,8
Ретикулоциты, %
3,5±0,3
3,3±0,2
Тромбоциты, тыс.
482±17
457±21,7
Вр.свертываемости, с
223±8,8
237±8,8
СО?, мм/час
2,7±0,7
3,3±0,3
Лейкоц., тыс/мм3,
в т.ч.:
12,0±1,2
13,7±1,4
Базофилы, %
0,3±0,3
0,7±0,7
?озинофилы, %
2,7±1,3
2,7±1,3
eные, %
0
0
Палочкоядерные, %
1,0±0,6
0,7±0,7
Сегментоядерные, %
27,7±1,2
32,7±3,3
Лимфоциты, %
61,3±2,3
58,0±5,0
Моноциты, %
7,0±1,5
5,3±0,7
Таблица 3. Гематологические показатели самок крыс через 24 часа после
трехкратного внутрибрюшинного введения препарата перфторан в дозе 30 мл/кг
Показатель, ед.
измерения
Препарат
Физ. р-р
Перфторан
Гемоглобин, ммоль/дм3
11,1±0,1
11,4±0,1
?ритроциты, млн/мм3
6,0±0,1
6,0±0,1
Гематокрит, %
46,4±1,4
43,9±0,6
Ср.объем эритроцита,
мкм3
77,0±3,1
72,8±0,7
Ретикулоциты, %
3,4±0,2
3,3±0,2
Тромбоциты, тыс.
488±13
452±30
Вр.свертываемости, с
216,7±12,0
270,0±45,8
СО?, мм/час
3,3±0,3
3,0±0,6
Лейкоциты, тыс/мм3,
в т.ч.:
12,2±1,5
10,3±0,9
Базофилы, %
0
0,3±0,3
?озинофилы, %
3,3±1,8
4,0±1,2
eные, %
0
0
Палочкоядерные, %
1,3±0,7
0,7±0,7
Сегментоядерные, %
24,3±1,2
34,0±4,0
Лимфоциты, %
65,3±0,9
54,3±5,0
Моноциты, %
5,7±1,2
7,3±0,7
Таблица 4. Биохимические показатели
сыворотки крови самцов крыс через 24 часа после трехкратного внутрибрюшинного
введения препарата перфторан в дозе 30 мл/кг
Показатель, ед. измерения
Препарат
Физ. р-р.
Перфторан
Общий белок, г/л
56,67±0,83
64, 44±4,01
Глюкоза, ммоль/л
6,45±0,20
9,29±0,41*
Мочевина, мкмоль/л
5,70±0,15
4,16±0,40*
Холестерин, ммоль/л
1,65±0,22
1,62±0,43
Креатинин, мкмоль/л
76,63±5,93
66,87±5,20
АлАТ, Е/л
25,30±4,29
24,30±1,85
АсАТ, Е/л
23,01±1,05
24,93±0,36
Щелочная фосфатаза Е/л
46,73±3,08
53,56±8,24
Билирубин, мкмоль/л
29,33±1,45
29,76±2,00
Примечание: знаком * помечены значения, достоверно отличающиеся от
контрольных
Таблица 5. Биохимические показатели
сыворотки крови самок крыс через 24 часа после
трехкратного внутрибрюшинного введения препарата перфторан
Показатель, ед. измерения
Препарат, доза
Контроль
Перфторан, 30 мл/кг
Общий белок, г/л
61,00±1,53
Список литературы
