Иммуногистохимический анализ динамики заживления кожных ран

Морфологические аспекты проблемы заживления ран продолжают оставаться в центре внимания исследователей на протяжении многих лет, несмотря на обилие литературных данных по этой проблеме. Не случайно, что на морфологических особенностях раневого процесса, включающих результаты гистологического, гистохимического и электронно-микроскопичес-кого исследования, базируется установление прижизненности и давности причинения повреждений при производстве судебно-медицинских экспертиз.

По сложившейся традиции, определение сроков возникновения повреждений основано на выяснении степени выраженности и соотношения в пораженных тканях процессов альтерации, воспаления и регенерации, сопровождающих прижизненную реакцию организма на любое травматическое воздействие. Однако в судебно-медицинской практике оценка проявления этих процессов на гистологических препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, не всегда удовлетворяет экспертов. Получаемая информация, как правило, не отражает уровень дифференцировки клеточных элементов и степень зрелости тканевых структур, что приводит к существенной ошибке при интерпретации результатов гистологического исследования.

Определенные перспективы в объективизации реактивных изменений и регенераторных процессов, развивающихся в зоне повреждений, открываются в связи с использованием в судебно-гистологической практике иммуногистохимических методов, основанных на высокоспецифичном взаимодействии антигена с антителом и позволяющих при наличии соответствующих меченых антител выявлять практически любой тканевой или клеточный антиген. Преимущество этих методов исследования стало очевидным после разработки техники получения моноклональных антител и выявления маркеров промежуточных филаментов, рецепторов факторов роста, молекул адгезии и других. Достигнутые успехи в области иммуноморфологии уже нашли свое отражение в судебно-медицинских исследованиях (Int.J.Legal Med., 1992-1999), касающихся методических подходов к оценке заживления кожных ран и разработки критериев давности причинения повреждений.

Для этих целей в иммуногистохимических исследованиях используются маркеры различных клеточных элементов, антитела к молекулам адгезии, компонентам внеклеточного матрикса, про- и противоапоптозным белкам, а также к антигенам пролиферирующих клеток. В ряде работ P.Betz e.a. (1992-1995) на основании изучения локализации цитокератинов 5 и 13 прослежена динамика реэпителизации кожных ран и распределения в них маркера пролиферации антигена Ki 67, что позволило обнаружить пролиферирующие фибробласты начиная с 1,5 суток после повреждения. Использование комплекса моно- и поликлональных антител дало авторам возможность получить ценную информацию о прижизненности и сроках образования ран кожи на основе изучения вновь синтезируемого коллагена различных типов, тенасцина, ламинина, гепарансульфат протеогликана, альфа-I-антихимотрипсина. Ими также было установлено повышение содержания фибронектина во внеклеточном матриксе соединительной ткани уже через несколько минут после травмы, даже до появления в зоне повреждения гранулоцитов. Диагностическая значимость изменений содержания и локализации фибронектина в ранах была подтверждена исследованиями P.Klir е.а. (1996).

Проведенное J.Dressler е.а. (1997, 1999) иммуногистохимическое изучение кожных ран способствовало обнаружению стойкой экспрессии ICAM-I (CD 54) в кератиноцитах и эндотелиоцитах на сроках повреждения кожи от 1,5 часов до 3,5 суток, что коррелировало со степенью воспаления в ранах. Этими авторами прослежены особенности состояния молекул адгезии на эндотелии сосудов пораженной кожи по интенсивности позитивной реакции на VCAM-I (CD 106) и PECAM-I (CD 31), наиболее выраженной на сроках от 3 часов до 3,5 суток. Ими же была установлена строго положительная иммуногистохимическая реакция на Р-селектин в интервале от 3 минут до 7 часов после повреждения кожи. Это дало основание рассматривать полученные результаты в качестве индикаторов прижизненности и давности причинения ран кожи. Подобную значимость может иметь степень экспрессии белка р53 фибробластсами поврежденной ткани, отчетливо прослеживаемая спустя 3 суток с максимальной выраженностью между 3-11 неделями (R.Hausmann е.а., 1998), а также положительная иммуногистохимическая реакция на интерлейкин-1 альфа в активированных нейтрофилах при сроках повреждения кожи от 4 часов до 1 суток (Т.Kondo е.а., 1999).

Ключевым звеном в процессе заживления ран является регенерация поврежденных тканей, во многом связанная с интенсивностью пролиферации клеточных элементов. Необходимым компонентом репаративной регенерации кожи служат фибропластические процессы, приводящие к образованию рубцов, структурные особенности которых могут отражать давность (срок) причинения повреждений. Это в значительной мере определяет целесообразность изучения в пораженных участках кожи экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA). Предварительные результаты наших исследований, проведенных на крысах с нанесением в области спины стандартных резаных ран кожи или термических повреждений IIIб степени, свидетельствовали о возрастании на 2-3 сутки количества пролиферирующипх клеток в базальном слое эпидермиса и на незначительном удалении от границ повреждения в сосочковом и сетчатом слоях дермы. В зависимости от характера повреждения кожи достоверное увеличение экспрессии PCNA в разных участках механических и термических повреждений, как правило, ограничивалось интервалом 1-2 недели. Сопоставление полученных данных с результатами гистологического и морфометрического исследования позволило установить временные соотношения между пролиферативной активностью клеточных элементов и мобилизацией клеток по краям повреждения, миграцией эпителиоцитов на раневой поверхности, выраженностью фибропластических процессов, интенсивностью формирования волокнистых структур в различных зонах пораженной кожи.

Интенсивность процесса гибели клеток может служить надежным критерием оценки особенностей репаративной регенерации кожи и, следовательно, давности причинения повреждений. С этой точки зрения представляется оправданным использование маркеров гибели клеток для установления объема популяции кератиноцитов и клеток соединительной ткани, вступающих в апоптоз в результате повреждения (Bcl-2, Bax, CD 95, p53).

Анализ данных литературы и предварительные результаты наших исследований показывают, что характер основных событий, развивающихся в коже после причинения повреждений, можно установить при использовании, наряду с уже отмеченными, следующих маркеров.

М?а?р?к?е?р?ы К?л?е?т?о?ч?н?ы?е ? т?и?п?ы Цитокератины К5 и К14 Кератиноциты Десмин, альфа-гладкомышечный актин Миофибробласты CD 15 Гранулоциты Интерлейкин-1 альфа Активированные нейтрофилы LCA Лимфоциты CD 68, альфа-1-антихимотрипсин Моноциты ED 1 Макрофаги CD 41 Тромбоциты CD 56 NK-cell (естественные киллеры)

Наши наблюдения за динамикой заживления термических ожогов и резаных ран у крыс свидетельствуют о целесообразности одновременного применения в иммуногистохимических исследованиях набора маркеров различных клеточных элементов и тканевых структур (панели моно- и поликлональных антител). Объективизировать получаемую при этом информацию следует путем использования различных приемов морфометрического анализа, позволяющих на иммуногистохимических препаратах определять точную локализацию, а также количественное соотношение клеточных элементов и тканевых структур в зоне повреждения. Таким образом, внедрение в экспертную практику методов иммуногистохимического анализа означает переход на более высокий уровень изучения посттравматической регенерации тканей, что должно способствовать разработке достоверных критериев оценки прижизненности и давности (сроков) причинения повреждения.

Список литературы