Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Рассматривается гипотеза, утверждающая, что по своему первичному механизму биологическое старение есть "болезнь количественных признаков", на течение которой влияет характер функционирования ионной модуляции транскрипционной продуктивности генов. Эта ионная регуляция основана на участии так называемой фонтанной РНК (фРНК). Согласно рассматриваемой фонтанной теории ионной модуляции экспрессии генов, их продуктивность меняется в зависимости от поступления ионов из перинуклеарной цистерны внутрь ядра через предполагаемые фРНК-зависимые ионные каналы внутренней ядерной мембраны. Когда теломеры делаются в стареющих клетках слишком короткими, фРНК-зависимые ионные каналы могут становиться (вероятно, до G1/S перехода в клеточном цикле) недоступными для субтеломерных генов, что обусловлено особенностями взаимодействия конденсированного укороченного теломерного спейсера с так называемым армирующим щитом ядерной оболочки. Это может количественно менять продуктивность соответствующих генов и служить фактором клеточного старения.
Ключевые слова: старение, количественные признаки, ядро, фонтанные РНК (фРНК), ионы, теломера, энхансеры, транспозоны.
ФОНТАННЫЙ МЕХАНИЗМ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ МОДУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПРИЗНАКОВ КАК ПРЕДПОСЫЛКА ДЛЯ ОБЪЯСНЕНИЯ ФЕНОМЕНА КЛЕТОЧНОГО СТАРЕНИЯ
В настоящем сообщении я исхожу из утверждения, что клеточное старение, равно как и системное старение всего многоклеточного организма, есть универсальная хроническая "болезнь количественных признаков". Элементарным примером количественного признака, кодируемого любым структурным геном в клетке может служить та концентрация молекул мРНК, которая возникает в ядре под контролем соответствующего гена. Предполагается, что возраст-зависимые изменения клеток и системные изменения стареющего организма в целом, являются в основном результатом чисто количественных изменений активности многих структурных генов. Даже полная утрата функции определенной физиологической системы, такой, например, как репродуктивная, есть лишь вторичный результат первоначальных изменений определенных количественных признаков в соответствующих клетках. Качественные изменения, такие как седина, появление пигментных пятен на старческой коже, накопление сшивок в макромолекулах и т.п., есть, как можно полагать, вторичные эффекты. Они связаны с работой гомеостатических систем стареющего организма, с течением времени все менее успешной, и нацеленной на то, чтобы тем или иным способом компенсировать возраст-зависимые изменения количественных признаков. Не случайно, несмотря на многочисленные попытки, так и не найдено никаких генов, которые впервые начинали бы экспрессироваться именно при старении человека, но молчали во всех клетках того же организма, пока он был в расцвете физических сил.
Если старение клеток и базирующееся на нем системное старение многоклеточного организма есть действительно, как здесь рассматривается, универсальная хроническая "болезнь количественных признаков", то необходимо ответить на вопрос о первопричине самой этой болезни, которая настолько универсально распространена, что и болезнью отнюдь не считается. Следует отметить, однако, что В.М. Дильман оценивал старение именно как болезнь и особо выделял аспект проблемы, связанный с количественными возрастными изменениями в системе нейро-эндокринной регуляции человека [1,2,14]. Теперь, в рамках рассматриваемой здесь фонтанной теории регуляции эукариотических генов в развитии и старении, впервые представляется возможность рассмотреть ключевой молекулярный аспект проблемы старения как универсальной болезни количественных признаков у эукариотических организмов, в том числе и у человека.
Цель настоящего сообщения состоит в попытке предложить молекулярное объяснение старению именно как болезни количественных признаков. Суть старения как болезни можно истолковать на основе рассматриваемой здесь гипотезы о роли так называемой фонтанной РНК (фРНК), участвующей в ионной модуляции уровня экспрессии эукариотических генов.
Несмотря на значительные успехи биологии клеточного старения, в том числе успехи теломерной биологии, основанные на исследовании предсказанного мной ранее эффекта укорочения теломер при старении клеток, все еще остается не до конца объясненным механизм, позволяющим клеткам менять свою активность параллельно с укорочением теломер при старении. Можно предположить, что в процесс старения эукариотических клеток вовлечен особый механизм ионной модуляции уровня экспрессии генов, именуемый здесь фонтанным механизмом. Согласно фонтанной теории, продуктивность генов меняется в зависимости от поступления ионов из перинуклеарного пространства внутрь ядра через внутреннюю ядерную мембрану. Предполагается, что к числу ионных каналов относятся кальциевые и цинковые каналы. Каждый из них открывается только на очень короткий срок в результате взаимодействия фРНК с закрытыми белковыми воротами канала. Это взаимодействие становится возможным лишь после того, как фРНК (или фРНП) осуществит комплементарное специфическое взаимодействие с участком ДНК, находящимся вблизи соответствующего гена. Такой участок ДНК, акцептирующий молекулу фРНК, обозначается здесь как конвертер. Только после взаимодействия фРНК с конвертером возникающий ДНК-РНК-белковый комплекс способен индуцировать кратковременную активацию закрытого специфичного ионного канала. Канал открывается на срок, необходимый и достаточный для перемены конфигурации белковых компонентов ионного канала, которая индуцируется взаимодействием с лигандом, в данном случае с фРНК (или белковым комплексом, в состав которого входит фРНК). Ионы поступают к хроматину из перинуклеарного пространства только в момент указанной конфигурационной перестройки канала. Канал после этого немедленно закрывается. В результате каждая молекула фРНК способна вызвать поступление внутрь ядра лишь небольшой порции ионов. При этом ионы поступают в ядро из перинуклеарной цистерны по градиенту концентрации исключительно за счет пассивной диффузии. Специфичность поступающего иона определяется специфичностью фРНК и самого ионного канала, кратковременно активируемого взаимодействием с указанным лигандом. Перинуклеарное пространство, или что то же самое, перинуклеарная цистерна, используется в данном процессе как резервуар, в котором осуществляется кондиционирование ионов, то есть поддержание их оптимальной концентрации. Она относительно независима от содержания ионов в цитоплазме и кариоплазме. Для осуществления указанного кондиционирования клетка расходует энергию, но сам выход ионов из перинуклеарного пространства к хроматину, осуществляемый за счет пассивной диффузии, не требует расхода АТФ. Для указанных целей могли бы в принципе использоваться как специализированные ионные каналы, так и, например, такие Ca2+ и Zn2+ каналы, которые могут быть активированы и иными лигандами, не имеющими отношения к фРНК. Последний вариант наиболее вероятен. В результате кратковременного включения фРНК-зависимых ионных каналов, они осуществляют однократный вброс специфических ионов. Работу таких ионных каналов можно, фигурально выражаясь, сравнить с деятельностью гейзеров; учитывая эту аналогию, рассматриваемый механизм можно обозначать как фонтанный, или гейзерный, механизм. В результате кратковременного акта активации ионного фонтана ( в случае, если он формируется вблизи определенного гена), должно меняться локальное ионное окружение хроматина, что, в свою очередь, могло бы влиять на продуктивность соответствующего гена, в частности, на стабильность мРНК, на процесс созревания транскриптов и/или конфигурацию хроматина, транскрипционную активность гена и т.д. Предполагаемые фРНК-зависимые ионные фонтаны, или гейзеры, могли бы служить важным механизмом, модулирующим количественные признаки клетки и, соответственно, количественные признаки эукариотического организма. Предполагается, что эукариоты, то есть ядерные организмы, стали эукариотами именно для того, чтобы получить возможность фРНК-зависимой модуляции своих количественных признаков, а не только, и даже не столько, для того, чтобы упаковывать геном или изолировать его от внешних воздействий. Уместно заметить, что ядерная мембрана является в определенной мере даже источником потенциальной опасности для генома в тех случаях, когда клетка подвергается стрессирующим воздействиям, приводящим к появлению в мембранах свободных радикалов, способных повреждать генетический аппарат. Несмотря на эту опасность природа пошла на создание сложнейшей мембранной структуры, охватывающей эукариотический геном. Почему эволюция поступила именно так? Можно предположить, что открывающаяся при этом возможность количественной модуляции признаков значительно перевесила все недостатки, связанные с владением ядерной оболочкой (это - опасность генерации в липидах свободных радикалов при стрессах, необходимость организации сложного нуклео-цитоплазматического экспорта и импорта через ядерные поры и т.п.). Обладание упомянутыми фРНК-зависимыми ионными каналами открывает возможность модулировать ионами активность различных ядерных белков. К их числу относятся металл-активируемые транскрипционные факторы, многие из которых, например, имеют так называемые цинковые пальцы. Использование для количественной модуляции признаков ионных каналов разной специфичности, то есть цинковых, кальциевых и, возможно, некоторых других, расширяет возможности и гибкость фонтанной системы модуляции активности ядра. В ходе клеточного старения активность фонтанной системы может меняться, и это могло бы коррелировать с укорочением теломер, обусловленного процессами концевого недокопирования ДНК.
Если принять, что теломерный гетерохроматин как особый теломерный спейсер высоко компактизован в G1-фазе или на границе G1-фазы и S-фазы клеточного цикла и что он присоединен к участкам перимембранного ядерного матрикса, образующего так называемые "армирующие щиты", то при этом создаются условия, затрудняющие использование фонтанного механизма теми хромосомными генами, которые локализованы вблизи теломер. В указанной ситуации компактизованный теломерный хроматин мог бы играть роль своеобразного теломерного спейсера, удерживающего ближайшие перителомерные гены на безопасном расстоянии от периметра армирующего щита. Этот щит, по сути дела, создает для системы ионных фонтанов "мертвую зону", ибо здесь внутренняя ядерная мембрана не доступна для контакта с ней конвертеров, то есть участков ДНК, акцептирующих фРНК и благодаря этому участвующих в активации ионных каналов. Поэтому длина теломеры как компактизованного спейсера может стать на определенной стадии клеточного цикла важным фактором регуляции уровня экспрессии генов, ближайших к теломере. Чем теломера оказывается короче в ходе клеточного старения, тем в большей степени указанные гены оказываются втянутыми в область армирующего щита и, соответственно, тем менее они оказываются доступными для рассматриваемого механизма ионной модуляции генной активности. Продукты различных генов участвуют в работе клеточного гомеостаза, будучи объединены в многочисленные цепи межмолекулярных взаимодействий. Поэтому понижение концентрации генных продуктов, кодируемых даже относительно небольшим числом генов, например, субтеломерных генов, с неизбежностью должно отразиться в неблагоприятную сторону на работе других клеточных генов и, в целом, на гомеостатических возможностях старых клеток по сравнению с "молодыми" клетками. Постепенное укорочение теломерных спейсеров может поэтому, при прочих равных условиях, вести к постепенному уменьшению функциональных возможностей клеток, то есть приводить к клеточному старению.
В предлагаемой фонтанной системе количественной модуляции признаков клетки, которая дополняет уже известные системы внутриядерных регуляций, в равной мере важны как конвертеры, то есть сайты ДНК, фланкирующие собой гены и ответственные за связывание молекул фРНК, так и те последовательности генома, которые кодируют саму фРНК. Поскольку фРНК нужна для модуляции активности генов, последовательности, которые кодируют фРНК, обозначены здесь как гены-модуляторы, или просто модуляторы. Если в ходе эволюции многоклеточных организмов, от амебы до человека, происходят разнообразные перемещения упомянутых элементов фонтанной системы относительно их прежней локализации в хромосомах, то эти перемещения могут и должны сопровождаться изменениями количественной модуляции уровня экспрессии соответствующих генов. Если это так, то транспозоны и ретропозоны как мобильные элементы эукариотического генома могли бы получить принципиально новую функцию. Эта функция есть количественное изменение признаков клеток и организмов в целом, осуществляемое в эволюции под контролем фРНК-зависимой ионной модуляции продуктивности отдельных регионов генома.
В рамках представлений о фонтанной системе модуляции генетической активности можно предположить, что энхансеры, которые, как известно, усиливают транскрипционную активность многих генов, могли бы использовать для достижения этой цели ни что иное, как предлагаемый здесь фРНК-зависимый механизм ионной модуляции уровня экспрессии генов. В этом случае многочисленные белки, входящие в уже обнаруженные так называемые энхансеросомы, могли бы, в частности, участвовать в создании наиболее оптимальных условий для взаимодействия молекул фРНК с конвертерами с последующей организацией вблизи соответствующих генов серии кратковременно активируемых и затем закрывающихся ионных каналов.
Следует заметить, что рассматриваемая здесь РНК-зависимая ионная система модуляции эукариотического генома способна играть важную роль не только в ходе нормального индивидуального развития. Она может также вовлекаться в патогенез различных заболеваний, в том числе генетических болезней, к которым относится и рак.
Рассматриваемый здесь механизм ионной модуляции уровня экспрессии генов и его приложение к проблемам биологии клеточного старения были частично рассмотрены ранее в [33,34] и на двух конференциях - в Сан-Франциско и Гейдельберге, обе в 1998 году, посвященных роли теломер в биологии стареющих и раковых клетках. Поскольку уже доказана предсказанная мной корреляция между процессом укорочения теломер и старением клеток размножающегося клона, представляет интерес выяснение возможного причинного механизма подобной корреляции. Соответствующие предсказания и история вопроса изложены в работах [5,6,31,7,32]. Природу теломерного сигнала можно было бы понять с учетом развиваемых представлений о фонтанном механизме модуляции активности генов.
Итак, согласно фонтанному, или гейзерному, механизму модуляции активности эукариотических генов, необходимо, чтобы происходило взаимодействие молекул фРНК с конвертерами, то есть с сайтами ДНК, акцептирующими фРНК. Как может возникать такая комплементарность в ходе эволюции геномов? Где кодируются молекулы фРНК? Эти и близкие к ним вопросы рассматриваются в следующем разделе.
ГДЕ КОДИРУЮТСЯ РАЗНЫЕ МОЛЕКУЛЫ фРНК? ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ СУБТЕЛОМЕРНОЙ ДНК И МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ
Постулируемый мной новый класс малых ядерных РНК, а именно фонтанных РНК (фРНК), выполняет роль сигнальных лигандов, взаимодействующих с другими сигнальными системами ядра, количественно меняя продуктивность генов. Компоненты фонтанной системы рассеяны по хромосомам, причем сами фРНК преимущественно кодируются в субтеломерных областях, где находятся соответствующие гены-модуляторы, или просто модуляторы. Сайты ДНК, связывающие фРНК, обозначенные как конвертеры, находятся по соседству со структурными генами. Эволюционное изменение числа конвертеров вблизи любого данного гена, при прочих равных условиях, в определенных пределах пропорционально увеличивает генную продуктивность. Компоненты фонтанной системы могут находиться на фланге или флангах гена как стабильная часть хромосомной ДНК и в ходе индивидуального развития и старения распределение конвертеров по геному человека, конечно, не меняется.
Однако, конвертеры могут присутствовать в повторах транспозонов (а именно, в так называемых LTR). Одна из основных эволюционных функций транспозонов могла бы состоять в перемещении по геному конвертеров и других элементов, обеспечивающих работу фРНК-зависимого ионного механизма модуляции транскрипционной активности эукариотических генов. Мобильные элементы в этом случае получают возможность играть важную роль в эволюции, ибо адаптация в значительной мере зависит от дифференциального изменения продуктивности структурных генов и кодируемых ими количественных признаков. Мобильные элементы, перемещаясь от гена к гену, могли бы в контексте фонтанного механизма менять концентрацию генного продукта. Помимо этого, перемещение мобильных элементов по геному в ходе эволюции могло бы выполнять еще и своеобразную спейсорную функцию. Ее суть состоит в разнесении в пространстве тех ионных каналов, которые обслуживают разные гены. Если даже не производящие никаких фонтанов какие-либо транспозоны встают в качестве разделяющего спейсора между смежными генами, то этим предотвращается нежелательная интерференция ионных фонтанов, организованных возле каждого из генов. Кроме того, транспозон или ретропозон, внедряясь между фонтанным конвертером и его структурным геном дистанционно разобщает их, и это приводит к снижению транскрипционной активности гена. Мобильный элемент может также приносит с собой альтернативный конвертер, то есть конвертерную ДНК, способную акцептировать фРНК, которая будет участвовать в активации альтернативного ионного фонтана, оппозитно действующего на данный структурный ген.
Конкретный паттерн повторов данного межгенного спейсора, независимо от того сформирован он при участии транспозонов и ретропозонов или же возник за счет негомологичной рекомбинации хромосом, позволяет в эволюции менять расстояние между смежными генами в пространстве ядра за счет компактизации или декомпактизации повторов, входящих в состав данного спейсора, и при необходимости не только отдалять друг от друга неблагоприятно интерферирующие фонтаны, но и , напротив, сближать те гены, которые используют ионный "душ" в виде ионов одной и той же природы.
Количество и природа конвертеров, обрамляющие разные структурные гены могут быть неидентичными. Кроме того, конвертеры, фланкирующие с одной или обеих сторон разные гены, могут в принципе организовывать неодинаковые ионные каналы. Выбор диктуется нуклеотидной последовательностью данного конвертера. Например, вблизи одного гена активируются фРНК-зависимые Ca2+ -каналы, а вблизи другого гена фРНК-зависимые Zn2+ -каналы, создаваемые соответственно молекулами фРНК разной специфичности.
Для активации ионного канала при участии соответствующей молекулы фРНК необходимо сочетание комплекса факторов. Внутренняя ядерная мембрана, согласно предположению, несет в себе закрытые ионные каналы, потенциально способные пропускать в ядро специфические ионы. Некоторые из этих каналов являются кальциевыми, другие - цинковыми. Можно предположить также существование калиевых или некоторых других каналов у определенных объектов. Все эти каналы могут быть объектом регуляции различных, независимых от фРНК, лигандов. В то же время, молекулы фРНК, взаимодействуя с этими каналами, дают эффект, принципиально отличный от действия всех прочих возможных лигандов, которые могли бы также активировать эти каналы. Принципиальное отличие состоит в том, что молекулы фРНК обеспечивают топографическую селективность активации нужных фРНК-зависимых каналов. В отличие от прочих лигандов, специфические фРНК связываются, например, не со всеми кальциевыми каналами данного ядра, а лишь с теми из них, которые находятся вблизи, например, генов А, В, и С, расположенных на значительных расстояниях друг от друга, и даже, например, на разных хромосомах. Такая топологическая селективность обеспечивается комплементарным связыванием молекулы фРНК с конвертерной ДНК вблизи соответствующих генов.
Для того, чтобы указанное взаимодействие фРНК и конвертерной ДНК могло произойти, необходимо соблюдение следующих условий. Каждая молекула фРНК должна иметь, по крайней мере, два домена, вариабельный и константный. Вариабельный домен нужен для связывания РНК и ДНК, а константный домен, соответственно, например, кальциевый или цинковый домен, необходим для поиска и последующей активации расположенного в мембране пока еще закрытого ионного канала.
Как происходит взаимодействие вариабельного домена фРНК с комплементарным ему сайтом конвертера? Оно может происходить в принципе двумя разными способами. Первый состоит в том, что конвертерная двунитевая ДНК, взаимодействуя с внутренней ядерной мембраной, расплетается с образованием однонитевого сегмента, доступного для формирования дуплекса ДНК-фРНК. Формирование этого дуплекса приводит к конформационному изменению в константном домене фРНК, который после этого приобретает способность к взаимодействию с белком закрытого ионного канала. Указанные события могут происходить с участием вспомогательных белков, образующих рибонуклеиновый комплекс с фРНК.
Второй возможный вариант взаимодействия фРНК с ДНК конвертера, расположенного недалеко от ядерной мембраны и локализованного в хромосомной ДНК вблизи участков заякоривания петли хроматина, несущей в себе соответствующий структурный ген, может выглядеть несколько иначе. Как и в предыдущем варианте, конвертерная ДНК распознается в однонитевой форме. Однако, взаимодействует с однонитевой конвертерной ДНК особая форма фРНК, которая приобретает двунитевую структуру. Двунитевая РНК образует триплекс с однонитевой конвертерной ДНК. Возникший триплекс распознается соответствующими белками (триплеринами), которые после этого приобретают способность к специфической активации расположенных рядом закрытых ионных каналов. Ионный канал открывается на короткий срок. Продолжительность этого временного интервала , лимитируется продолжительностью конформационной перестройки, происходящей во взаимодействующих между собой белках, а именно в белке, связавшемся с триплексом, то есть в триплерине, и в белке закрытого ионного канала. В результате ионный канал обеспечивает однократную инжекцию дозированной порции определенного ион, после чего канал вновь закрывается. Преимущество этого триплексного варианта над выше упомянутом первым, то есть дуплексным, вариантом могло бы состоять в большей устойчивости триплекс-содержащего комплекса.
Для организации комплекса РНК-РНК-ДНК необходимо формирование двунитевой конфигурации РНК. Она могла бы возникать, например, за счет складывания самой молекулы фРНК. Однако, как можно предположить, возможен и еще один, на первый взгляд более сложный молекулярный сюжет. Он состоит в том, что двунитевой участок молекулы фРНК формируется за счет взаимодействия с "посторонней" молекулой РНК, которая кодируется участком ДНК, расположенным вблизи данного или другого структурного гена. Эта РНК есть ни что иное как своеобразный антисенс, комплементарный к вариабельному домену фРНК. То есть речь идет о природной антисенсной фРНК. Такое, на первый взгляд усложняющее условие, в действительности открывает дополнительные возможности для взаимодействия генов внутри эукариотического генома, создавая условия для своеобразных диалогов между разными генами и генными кластерами. В качестве источника молекул этих антисенсов, которые удобнее назвать как диалоговая РНК (дРНК), образующих дуплекс с вариабельным доменом соответствующей молекулы фРНК, могли бы, в частности, выступать те молекулы РНК, которые транскрибируются вблизи хромомеров с так называемых междисковых сегментов хромосом, транскрипция которых, например, давно документирована для политенных хромосом, хотя функция их остается не полностью проясненной. Дуплекс в виде дРНК-фРНК образует далее триплекс с однонитевым сегментом конвертерной ДНК, локализованной вблизи или в составе так называемых MAR, то есть элементов оснований петли ДНК, способной заякориваться при определенных условиях вблизи внутренней ядерной мембраны.
Образование триплекса дРНК-фРНК-ДНК может использоваться в эукариотическом геноме для двух разных, хотя и не взаимоисключающих целей. Первая цель - это формирование ионных каналов вблизи соответствующих структурных генов с целью модуляции продуктивности транскрибируемого гена. Независимо от того, как именно активируется фРНК, итогом оказывается кратковременное открывание ворот ионного канала. В зависимости от природы ионного канала и количества конвертеров и приходящих к ним молекул фРНК транскрипционную продуктивность генов в эволюции можно количественно регулировать этим своеобразным "ионным реостатом". Использование триплексов представляется более многообещающим не только по соображениям их устойчивости в комплексе с соответствующими белками, но и ввиду относительной уникальности самих триплексов, облегчающих их поиск в геноме соответствующими белками, обозначенными как триплерины. Вторая возможная цель и преимущество использования упомянутых триплексов дРНК-фРНК-ДНК состоит в маркировании флангов соответствующего гена либо генного кластера для последующей декомпактизации (либо компактизации) нужного участка хромосомы, в зависимости от природы, связанных с данным сегментом белков, а также природой ионов, которые поступают через соответствующий канал.
Этот механизм, который можно обозначить здесь как "триплексный механизм маркирования" хромосомных сегментов мог бы, как я полагаю, использоваться вообще в ходе любого клеточного цикла у эукариот в случае необходимости селективной переупаковки хроматина ради создания новых сегментов эухроматина и нового паттерна гетерохроматизации. Подобная необходимость может возникать в процессе осуществления клетками процессов клеточной дифференцировки, которые требуют для своего осуществления как раз изменения паттерна компактизации хроматина. Диалоги генов и межгенных кластеров, осуществляющиеся, в частности, посредством упомянутых дРНК, могли бы способствовать осуществлению процессов репрограммирования генома, происходящих в ходе различных клеточных дифференцировок.
Что касается источника фРНК, то они могли бы кодироваться, помимо субтеломерных регионов хромосом и LTR транспозонов, также и некоторыми другими сегментами, например, находящимися в районе ядрышковых организаторов.
Ионы кальция, диффундирующие соответственно через ф(Ca)РНК-зависимый канал, могли бы увеличивать срок жизни информационной РНК. Изменение локальных ионных концентраций могло бы влиять не только на процесс созревания мРНК и срок выживания транскриптов, но и на локальную конфигурацию хроматина.
Ионные каналы, активируемые на короткий срок при участии специфических молекул фРНК, неслучайным образом распределяются как вдоль хромосомы, так и в самой трехмерной структуре ядра, что необходимо, во-первых, для предотвращения нежелательной интерференции ионных фонтанов разной природы, и во-вторых, для обеспечения кооперации ионных каналов в тех хромосомных сегментах, которые в этом нуждаются.
Поскольку компоненты фонтанной системы взаимодействуют между собой, они должны иметь общее эволюционное происхождение. Этому, как можно предположить, способствует интеграция субтеломерных регионов в некоторые внутрихромосомные районы, а это может происходить как за счет негомологичных рекомбинаций, а также путем обратных транспозиций, связанных с внедрением в геном копий молекул фРНК, изготовленных с участием обратной транскриптазы. Что касается негомологичных рекомбинаций, то они могут происходить, например, в ходе хромосомной эволюции на фоне слияний и разрывов концов разных хромосом и последующих перемещений некоторых из прежних субтеломерных регионов в состав межгенных повторов. Подобная диверсификация создает предпосылку для взаимной комплементарности происходящих из одного источника модуляторов (то есть последовательностей, кодирующих фРНК), конвертеров (то есть последовательностей, акцептирующих молекулу фРНК) и междисковых сегментов, кодирующих, в частности, дРНК (дРНК комплементарна вариабельному домену фРНК, который, в свою очередь, комплементарен конвертерной ДНК).
ПОЧЕМУ МНОГИЕ ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ ИМЕЮТ ЦИНКОВЫЕ ПАЛЬЦЫ? НЕЛЬЗЯ ЛИ ОБЪЯСНИТЬ АКТИВНОСТЬ ЭНХАНСЕРОВ, САЙЛЕНСЕРОВ И ИНСУЛЯТОРОВ В РАМКАХ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О ФОНТАННОМ МЕХАНИЗМЕ ?
Итак, фонтанный механизм, то есть фРНК-зависимая ионная регуляция свойств хроматина и внутриядерной экспрессии генов, действует как своеобразный ионный реостат, способный в зависимости от числа конвертеров вблизи гена и других обстоятельств количественно менять в эволюции особенности признаков клеток и организмов. Индивидуальные эукариотические гены при каждом данном цитофенотипе нуждаются в строго определенном ионном окружении. Приняв указанные утверждения, можно по-новому объяснить некоторые особенности энхансеров, сайленсеров и инсуляторов, а также некоторые свойства ядерных белковых факторов.
Известно, что ионы Mg2+ и Ca2+ распределены вдоль хромосом неравномерно [24]. Многочисленные исследования указывают на возможную роль ионов в активности генов. В частности, Крегер и другие указали на возможность регуляции процесса пуффирования политенных хромосом под воздействием некоторых ионов и гормонов [21-23,9,25,3]. Найдены также доказательства существования во внутренней ядерной мембране Ca2+ каналов, которые могут активироваться инозитол-трифосфатом или cADP-рибозой [35]. Longin и другие [26] не только наблюдали присутствие кальциевых и цинковых каналов в ядре, но и показали их способность открываться и закрываться на короткие интервалы в пределах около 4-5 ms, причем эти каналы были нечувствительны к некоторым известным блокаторам ионных каналов. Longin с соавторами подчеркнули, что роль обнаруженных ими каналов остается неизвестной. Ca2+ каналы найдены также в работе [27]. Перинуклеарная цистерна ядерного конверта имеет сравнительно небольшой объем, но он увеличивается, если возрастает метаболическая активность ядра [4]. Структура и функции ДНК меняются в зависимости от ионного окружения [18]. Ca2+ может увеличивать транскрипционную активность и стабильность мРНК [10].
Многие ядерные белки имеют цинковые пальцы. Известно, что участие ионов цинка может сильно увеличивать прочность образующихся макромолекулярных комплексов, однако, некоторые из белков обходятся без ионов цинка, используя, например, соответствующие физико-химические особенности лейцина или прибегая к другим факторам. Некоторые транскрипционные белки имеют лейциновые застежки-молнии [29]. Цинковые пальцы используются в белках и вне ядра. Я выдвигаю предположение, что поразительно широкое использование ионов цинка компонентами транскрипционных комплексов обусловлено прежде всего тем, что ион цинка мог бы легко использоваться фонтанным механизмом для регуляции процессов транскрипции. Известно, что ядерные гормональные рецепторы составляют большую семью транскрипционных факторов, обладающих цинковыми пальцами.
Локальный дефицит цинковых ионов, как и их дозированный избыток, могли бы, по-видимому, радикальным образом менять транскрипционную активность того или иного гена. Имея в своем распоряжении по меньшей мере два разных иона и варьируя вблизи генов содержание кальция и цинка, клетка получает возможность неслучайным образом и на альтернативной основе усиливать или тормозить активность соответствующих структурных генов. Используются ли при этом еще и другие ионные каналы, такие как гипотетический фРНК-зависимый калиевый канал, предстоит выяснить экспериментально.
В связи с этими обстоятельствами любая эукариотическая клетка получает возможность манипулировать активностью генов с помощью так сказать своеобразного "ионного кода". В зависимости от природы конвертеров, необходимых для формирования того или иного ионного канала вблизи данного структурного гена, и в зависимости от специфичности белков хроматина, связанных с данным сегментом хромосомы, изменение локального ионного окружения может и неизбежно должно вести к неслучайным и противоположно направленным изменениям в конфигурации хроматина, доступности локализованных в нем генов и их продуктивности. При прочих равных условиях, например, гены А и В, фланкированные разным количеством одинаковых конвертеров, будут иметь разную продуктивность. Допустим теперь, что цинковые ионы активируют те участки хроматина, в которых локализованы гены А и В, тогда как кальциевые ионы оказывают противоположный эффект. В соответствии с этим, потеря геном А в ходе эволюции цинк-специфичного конвертера и приобретение кальций-специфичного конвертера будет вести к ослаблению количественного признака, кодируемого этим геном А. Для какого-либо одного гена оптимальным будет "ионный код" в виде одних только кальциевых конвертеров, то есть конвертеров, связывающих лишь ф(Ca)РНК. "Ионный код" другого гена или генного кластера - это обладание только цинковыми конвертерами. Третий вариант "ионного кода" - это обладание смесью кальциевых и цинковых конвертеров. Если бы в фонтанной системе могли бы использоваться также и калиевые конвертеры, это дополнительно увеличивало бы разнообразие возможных комбинаций ионных конвертеров, фланкирующих те или иные сегменты генома.
Уместно отметить, что была продемонстрирована способность некоторых регионов сателлитной ДНК формировать комплексы с РНК, причем такие комплексы были необычно резистентны к нуклеазам [28], что заманчиво сопоставить с возможностью повышенной резистентности к нуклеазам постулированных выше триплексов дРНК-фРНК-ДНК, соединенных с белком-триплерином. Имеются также свидетельства в пользу прочной ассоциации некоторых молекул РНК с ядерной мембраной [28,15], что также не противоречит предположению об интеграции молекул фРНК в комплекс, взаимодействующий с канальными белками внутренней мембраны ядра. Следует подчеркнуть, что работа фонтанного механизма может быть эффективна только при условии, что регулирующие нуклео-цитоплазматический транспорт ядерные поровые комплексы отсутствуют или закрыты вблизи работающих фРНК-зависимых ионных каналов. В этой связи уместно отметить, что ворота ядерных поровых комплексов способны обратимо закрываться [19], что при определенных условиях могло бы предотвращать вхождение через ядерный поровый комплекс любых посторонних ионов, препятствующих нормальной работе фонтанного механизма.
В контексте работы фонтанного механизма ионной модуляции эукариотических генов представляется возможным по-новому рассмотреть принцип работы таких генетических элементов, как энхансеры, сайленсеры, инсуляторы и MAR"ы. Они могут оказаться ничем иным как компонентами фонтанной системы модуляции уровней экспрессии генов у эукариот. Можно допустить, что в основе работы энхансеров, способных усиливать транскрипцию того или иного структурного гена, лежит обладание определенным конвертером (или кластером из конвертеров), способным связывать те молекулы фРНК, которые нужны для усиления работы данного структурного гена. Если принять, что энхансеры действительно являются участниками фонтанной системы регуляции эукариотического генома, то становится понятной ранее загадочная потребность во взаимодействии далеко отстоящего энхансера с промотором для того, чтобы энхансер мог начать оказывать свое усиливающее действие в отношении транскрипционной активности данного структурного гена. Что собственно происходит при таком взаимодействии, требующим участия многих регуляторных белков, составляющих энхансеросому? Мой ответ состоит в том, что это необходимо в основном для главной, если не единственной, цели - для физического подтягивания конвертеров этого энхансера как можно ближе к данному гену. В том случае, если такое взаимодействие происходит вблизи внутренней ядерной мембраны, то зависимые от этих энхансерных конвертеров ионные каналы окажутся доступными для соответствующего структурного гена. Разумеется, если аналогичное взаимодействие энхансера и промотора происходит в срединной части ядра, и энхансерные конвертеры не могут дотянуться до внутренней ядерной мембраны, то в такой ситуации предлагаемый механизм работы энхансера себя проявлять принципиально не может.
Если принять предлагаемое объяснение относительно энхансеров, то становится понятной и роль инсуляторов. Как известно, сравнительно короткие инсуляторные последовательности, если они находятся между энхансером и промотором, способны предотвращать формирование комплекса энхасера с промотором и не позволяют энхансеру усиливать работу соответствующего структурного гена. В контексте фонтанного механизма этот эффект блокирования энхансерной активности инсулятором объясняется невозможностью физически подтянуть конвертер(ы) данного энхансера к соответствующему структурному гену, когда ген находится вблизи внутренней мембраны ядра. Элементы прикрепления хроматина вблизи внутренней ядерной мембраны, то есть MAR-элементы, помогают вместе с тем также и закреплению конвертеров вблизи внутренней ядерной мембране. В этой связи следует заметить, что при определенных условиях структурный ген может пользоваться услугами по сути дела двух разных вариантов конвертеров - как собственных конвертеров, непосредственно фланкирующих его, так и тех конвертеров, которые ему приносит энхансер во "временный подарок".
Обзор ранней литературы о роли ионов как возможных регуляторов генов дан в работах [3,36,10]. Следует особо подчеркнуть, однако, что использование в качестве лигандов, открывающих ионные каналы именно молекул РНК, как это предлагается в фонтанной модели, открывает принципиально новые возможности весьма гибкого модулирования активности разных генов, чего лишены любые другие лиганды, такие как инозитол-трифосфат, экдизон и другие гормоны и прочие факторы, не способные распознавать специфические последовательности ДНК, в отличие от таких лигандов, как фонтанная РНК.
Полиморфизм микросателлитов и минисателлитов играет определенную, хотя все еще не объясненную роль в экспрессии многих генов, причем каждый аллеломорфный вариант этих генов имеет умеренный эффект в отношении данного фенотипа. Большинство количественных признаков контролируется не одной какой-то последовательностью, а с участием сложных наборов сателлитной ДНК [11]. В рассматриваемом контексте, указанный полиморфизм можно было бы истолковать как обладание указанными здесь компонентами фонтанной системы.
ФОНТАННЫЙ МЕХАНИЗМ И ПАТОЛОГИЯ
Фонтанный механизм наделен способностью модулировать количественные признаки, такие как темп роста, вес и высота тела, кровяное давление и т.п. В рассматриваемом контексте представляет интерес факт существования корреляции между вариабельными числами тандемных повторов и тяжестью некоторых заболеваний [30,16,20]. Пониженные темпы роста у детей и малый рост у их родителей коррелирует со значительным уменьшением количества C-гетерохроматина в субтеломерных и перицентромерных регионах [8]. Течение некоторых мультигенных болезней, в том числе и рака, частично может быть понято как особенности функционирования количественных признаков клеток [13]. Многие раковые клетки отличаются не только по специфическим мутациям структурных генов, но и по своим количественным признакам.
Известно, что при некоторых болезнях экспрессия генов находится под контролем так называемых модифицирующих локусов, или полигенов [17,12]. Возможно, что полигены как раз и являются членами фонтанной системы модуляции эукариотического генома.
Cледует заметить, что патология многих вирусных болезней могла бы отчасти в своих проявлениях зависеть от активности кодирующих фРНК модуляторов и конвертеров. Повышенная и пониженная резистентность или чувствительность разных людей к одной и той же инфекции может, среди прочих факторов, базироваться на уровнях экспрессии заинтересованных генов, а эти уровни как раз и контролируются доступностью для соответствующих генов конвертеров и других элементов фонтанного механизма. Это может быть верно для способности организма противостоять различным инфекциям, в том числе и таким как вирус иммунодефицита.
Если компоненты фонтанной системы действительно важны не только в норме, но и при патологии, то они могут стать потенциальными мишенями для соответствующей лекарственной терапии.
ФОНТАННЫЙ МЕХАНИЗМ И УКОРОЧЕНИЕ ТЕЛОМЕР
На определенной стадии клеточного цикла, например, при переходе от G1- к S-фазе высоко конденсированный теломерный гетерохроматин может играть роль спейсера, позволяющего субтеломерным генам избежать приближения к так называемой "мертвой зоне". Она соответствует тому участку околомембранного ядерного матрикса, так называемого армирующего щита, к которому прикрепляются на противоположных полюсах ядра хромосомные теломеры и центромеры. Будучи плотно упакованными в соответствующие периоды клеточного цикла, теломеры и центромеры могли бы обеспечивать поддержание определенного расстояния между ионными "мертвыми зонами" и ближайшими генами. "Мертвые зоны" обозначены так потому, что в этих местах липидная мембрана ядра, будучи прикрыта армирующими щитами, недоступна для образования в ней фРНК-зависимых ионных каналов. Лишь те гены, которые находятся далеко от этих щитов, могут подвергаться оптимальной фРНК-зависимой ионной модуляции их экспрессии. Чрезмерное укорочение гетерохроматинизированных теломерных спейсеров подтягивает субтеломерные гены слишком близко к "мертвой зоне", и это видоизменяет нормальную активность субтеломерных генов. Поэтому, не имея больше доступа к ионным фонтанам за переделами периметра армирующего щита, соответствующие гены вынуждены менять свою активность при чрезмерном укорочении теломеры. В этом смысле ионные "мертвые зоны" выступают как своеобразный эпигенетический фактор. Искусственное удлинение теломерных спейсеров может предотвращать втягивание генов в область "мертвой зоны" и потому способно, при прочих равных условиях, предотвращать развитие тех признаков стареющей клетки, если они обусловлены теломера-зависимым старением. Ввиду взаимодействия, по крайней мере, некоторых генных продуктов между собой, изменение продуктивности некоторых из генов, обусловленное эффектом укорочения теломеры, нарушает нормальную работу клеточного гомеостаза и ведет к снижению резистентности клеток к возмущающим воздействиям, то есть к клеточному старению.
Таким образом, в контексте представлений о фонтанном, то есть фРНК-зависимом ионном регулировании продуктивности генов эукариотических клеток, можно объяснить предсказанную ранее корреляцию между предсказанным ранее процессом укорочения теломер [5,6,31,32] в делящихся нормальных соматических клетках человека и животных, с одной стороны, и формированием признаков старения в этих клетках.
Эффекты положения, наблюдаемые в генах, изменяющих свою активность при приближении гена к теломере или центромере, являются обратимыми [37]. Некоторые из эффектов положения можно было бы объяснить субоптимальным ионным окружением, что обусловлено локальной недоступностью ионных каналов или присутствием ионного окружения, оказывающего компактизующий эффект в отношении данного сегмента хроматина.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Старение многоклеточного организма, в том числе старение организма человека, и старение клеток отличаются от старения делящихся клеток в культуре ткани, по крайней мере, в двух отношениях. Старение организма есть, безусловно, системный процесс, базирующийся на взаимодействии стареющих клеточных ансамблей, из которых состоит организм. Каждый из этих ансамблей может отличаться по темпам и признакам старения. Не вызывает сомнения, что многие делящиеся в организме клетки, например, фибробласты человека, не успевают за человеческую жизнь полностью исчерпать свой лимит Хейфлика. И в этом смысле этот лимит, при всей его абсолютной достоверности, является лабораторным феноменом. Этим его значение для геронтологии, впрочем, ни в коей мере не снижается, уже по одному тому, как сильно исследование этого феномена продвинуло вперед наше понимание механизмов клеточного старения. Тем не менее, остается весьма актуальным вопрос о том, что же является движущими силами старения тех клеточных ансамблей, которые не делятся во взрослом организме человека. Многочисленные данные свидетельствуют в пользу того, что старение организма человека и животных в значительной степени, если не в основном, связано со старением нейроэндокринных функций головного мозга, по поводу чего существует огромная литература. В контексте рассматриваемых в предлагаемой работе представлений о роли теломер и фонтанного механизма регуляции эукариотических генов неизбежен вопрос о том, можно ли привлечь эти механизмы к объяснению старения постмитотических нейронов головного мозга. Ведь эти клетки не пролиферируют и потому постулированный мной ранее процесс концевой недорепликации ДНК на концах хромосом, то есть в теломерах [5], к ним в принципе не применим. Означает ли это, что процесс концевого недокопирования ДНК поэтому не может быть привлечен для истолкования процессов старения неделящихся нейроэндокринных клеток мозга? Возможный ответ на этот вопрос предложен мной в работе 1992 года [7], где была предложена идея концевой недорепарации ДНК. Постулированный процесс неполного копирования конца ДНК должен проявлять себя как в делящихся, так и в постмитотических клетках по той причине, что ДНК-полимераза репаративного синтеза, подобно ДНК-полимеразе репликативного синтеза, не может заполнить концевую брешь на 5'-конце реплики ввиду отсутствия свободного 3'-конца, который способна наращивать ДНК-полимераза репаративного синтеза. Поэтому все те факторы, например, свободные радикалы, которые ведут к появлению соответствующих концевых брешей, должны с неизбежностью вести к укорочению концов двойной спирали ДНК даже и в постмитотических клетках. Поэтому, укорочение молекулы ДНК возможно и, например, в нейроэндокринных клетках мозга человека. Чрезмерное укорочение соответствующих буферных последовательностей ДНК, каковыми являются теломеры, может вести к соответствующим изменениям активности нейроэндокринных и других клеток, как делящихся, так и неделящихся. Возраст-зависимое нарушение нормальной продуктивности различных клеточных ансамблей, интегрированных в единый организм, приводит к ухудшению условий работы даже для тех клеточных ансамблей, которые еще сохранили в своих клетках достаточную длину той теломерной буферной ДНК, которая защищает собой расположенные вслед за ней информационно важные последовательности. В этом как раз и сказывается системный характер организменного старения. Я хотел бы предложить здесь следующую формулировку относительно процессов старения, независимо от того, происходят ли они на уровне организма или в отдельных клетках. Старение есть универсальная генетическая "болезнь количественных признаков". Сведения, добываемые цитогеронтологией на индивидуальных клетках и факты, полученные при исследовании организма как целого согласно говорят о том, что в ходе старения человека и животных не происходит экспрессии принципиально новых макромолекул. Все, что происходит при старении, этой все еще неизбежной универсальной генетической болезни, это именно не качественное, а количественное изменение различных признаков, число которых огромно. В качестве простой иллюстрации достаточно вспомнить возраст-зависимое изменение сердечно-сосудистой системы, иммунной системы, мышечной силы, уменьшение емкости легких, увеличение размера ядер в стареющих фибробластах, и т. д., и т. п. Если старение есть действительно болезнь количественных признаков, то уместно в рамках биогеронтологических исследований обратиться именно к тем ключевым молекулярным механизмам, которые лежат в основе регуляции у эукариот именно количественных признаков. Согласно рассмотренной в настоящем сообщении концепции, количественные признаки модулируются фРНК-зависимым ионным механизмом, или кратко фонтанным механизмом, модулирующим продуктивность генов у эукариот. Высшие животные и человек приобрели много преимуществ благодаря фонтанной системе модуляции работы генов, но они и платят за это тем, что страдают от болезней, не известных в прокариотическом мире.
Выполнение этой работы частично поддержано грантом РФФИ 98-04-48654
Ключевые слова: старение, количественные признаки, ядро, фонтанные РНК (фРНК), ионы, теломера, энхансеры, транспозоны.
ФОНТАННЫЙ МЕХАНИЗМ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ МОДУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПРИЗНАКОВ КАК ПРЕДПОСЫЛКА ДЛЯ ОБЪЯСНЕНИЯ ФЕНОМЕНА КЛЕТОЧНОГО СТАРЕНИЯ
В настоящем сообщении я исхожу из утверждения, что клеточное старение, равно как и системное старение всего многоклеточного организма, есть универсальная хроническая "болезнь количественных признаков". Элементарным примером количественного признака, кодируемого любым структурным геном в клетке может служить та концентрация молекул мРНК, которая возникает в ядре под контролем соответствующего гена. Предполагается, что возраст-зависимые изменения клеток и системные изменения стареющего организма в целом, являются в основном результатом чисто количественных изменений активности многих структурных генов. Даже полная утрата функции определенной физиологической системы, такой, например, как репродуктивная, есть лишь вторичный результат первоначальных изменений определенных количественных признаков в соответствующих клетках. Качественные изменения, такие как седина, появление пигментных пятен на старческой коже, накопление сшивок в макромолекулах и т.п., есть, как можно полагать, вторичные эффекты. Они связаны с работой гомеостатических систем стареющего организма, с течением времени все менее успешной, и нацеленной на то, чтобы тем или иным способом компенсировать возраст-зависимые изменения количественных признаков. Не случайно, несмотря на многочисленные попытки, так и не найдено никаких генов, которые впервые начинали бы экспрессироваться именно при старении человека, но молчали во всех клетках того же организма, пока он был в расцвете физических сил.
Если старение клеток и базирующееся на нем системное старение многоклеточного организма есть действительно, как здесь рассматривается, универсальная хроническая "болезнь количественных признаков", то необходимо ответить на вопрос о первопричине самой этой болезни, которая настолько универсально распространена, что и болезнью отнюдь не считается. Следует отметить, однако, что В.М. Дильман оценивал старение именно как болезнь и особо выделял аспект проблемы, связанный с количественными возрастными изменениями в системе нейро-эндокринной регуляции человека [1,2,14]. Теперь, в рамках рассматриваемой здесь фонтанной теории регуляции эукариотических генов в развитии и старении, впервые представляется возможность рассмотреть ключевой молекулярный аспект проблемы старения как универсальной болезни количественных признаков у эукариотических организмов, в том числе и у человека.
Цель настоящего сообщения состоит в попытке предложить молекулярное объяснение старению именно как болезни количественных признаков. Суть старения как болезни можно истолковать на основе рассматриваемой здесь гипотезы о роли так называемой фонтанной РНК (фРНК), участвующей в ионной модуляции уровня экспрессии эукариотических генов.
Несмотря на значительные успехи биологии клеточного старения, в том числе успехи теломерной биологии, основанные на исследовании предсказанного мной ранее эффекта укорочения теломер при старении клеток, все еще остается не до конца объясненным механизм, позволяющим клеткам менять свою активность параллельно с укорочением теломер при старении. Можно предположить, что в процесс старения эукариотических клеток вовлечен особый механизм ионной модуляции уровня экспрессии генов, именуемый здесь фонтанным механизмом. Согласно фонтанной теории, продуктивность генов меняется в зависимости от поступления ионов из перинуклеарного пространства внутрь ядра через внутреннюю ядерную мембрану. Предполагается, что к числу ионных каналов относятся кальциевые и цинковые каналы. Каждый из них открывается только на очень короткий срок в результате взаимодействия фРНК с закрытыми белковыми воротами канала. Это взаимодействие становится возможным лишь после того, как фРНК (или фРНП) осуществит комплементарное специфическое взаимодействие с участком ДНК, находящимся вблизи соответствующего гена. Такой участок ДНК, акцептирующий молекулу фРНК, обозначается здесь как конвертер. Только после взаимодействия фРНК с конвертером возникающий ДНК-РНК-белковый комплекс способен индуцировать кратковременную активацию закрытого специфичного ионного канала. Канал открывается на срок, необходимый и достаточный для перемены конфигурации белковых компонентов ионного канала, которая индуцируется взаимодействием с лигандом, в данном случае с фРНК (или белковым комплексом, в состав которого входит фРНК). Ионы поступают к хроматину из перинуклеарного пространства только в момент указанной конфигурационной перестройки канала. Канал после этого немедленно закрывается. В результате каждая молекула фРНК способна вызвать поступление внутрь ядра лишь небольшой порции ионов. При этом ионы поступают в ядро из перинуклеарной цистерны по градиенту концентрации исключительно за счет пассивной диффузии. Специфичность поступающего иона определяется специфичностью фРНК и самого ионного канала, кратковременно активируемого взаимодействием с указанным лигандом. Перинуклеарное пространство, или что то же самое, перинуклеарная цистерна, используется в данном процессе как резервуар, в котором осуществляется кондиционирование ионов, то есть поддержание их оптимальной концентрации. Она относительно независима от содержания ионов в цитоплазме и кариоплазме. Для осуществления указанного кондиционирования клетка расходует энергию, но сам выход ионов из перинуклеарного пространства к хроматину, осуществляемый за счет пассивной диффузии, не требует расхода АТФ. Для указанных целей могли бы в принципе использоваться как специализированные ионные каналы, так и, например, такие Ca2+ и Zn2+ каналы, которые могут быть активированы и иными лигандами, не имеющими отношения к фРНК. Последний вариант наиболее вероятен. В результате кратковременного включения фРНК-зависимых ионных каналов, они осуществляют однократный вброс специфических ионов. Работу таких ионных каналов можно, фигурально выражаясь, сравнить с деятельностью гейзеров; учитывая эту аналогию, рассматриваемый механизм можно обозначать как фонтанный, или гейзерный, механизм. В результате кратковременного акта активации ионного фонтана ( в случае, если он формируется вблизи определенного гена), должно меняться локальное ионное окружение хроматина, что, в свою очередь, могло бы влиять на продуктивность соответствующего гена, в частности, на стабильность мРНК, на процесс созревания транскриптов и/или конфигурацию хроматина, транскрипционную активность гена и т.д. Предполагаемые фРНК-зависимые ионные фонтаны, или гейзеры, могли бы служить важным механизмом, модулирующим количественные признаки клетки и, соответственно, количественные признаки эукариотического организма. Предполагается, что эукариоты, то есть ядерные организмы, стали эукариотами именно для того, чтобы получить возможность фРНК-зависимой модуляции своих количественных признаков, а не только, и даже не столько, для того, чтобы упаковывать геном или изолировать его от внешних воздействий. Уместно заметить, что ядерная мембрана является в определенной мере даже источником потенциальной опасности для генома в тех случаях, когда клетка подвергается стрессирующим воздействиям, приводящим к появлению в мембранах свободных радикалов, способных повреждать генетический аппарат. Несмотря на эту опасность природа пошла на создание сложнейшей мембранной структуры, охватывающей эукариотический геном. Почему эволюция поступила именно так? Можно предположить, что открывающаяся при этом возможность количественной модуляции признаков значительно перевесила все недостатки, связанные с владением ядерной оболочкой (это - опасность генерации в липидах свободных радикалов при стрессах, необходимость организации сложного нуклео-цитоплазматического экспорта и импорта через ядерные поры и т.п.). Обладание упомянутыми фРНК-зависимыми ионными каналами открывает возможность модулировать ионами активность различных ядерных белков. К их числу относятся металл-активируемые транскрипционные факторы, многие из которых, например, имеют так называемые цинковые пальцы. Использование для количественной модуляции признаков ионных каналов разной специфичности, то есть цинковых, кальциевых и, возможно, некоторых других, расширяет возможности и гибкость фонтанной системы модуляции активности ядра. В ходе клеточного старения активность фонтанной системы может меняться, и это могло бы коррелировать с укорочением теломер, обусловленного процессами концевого недокопирования ДНК.
Если принять, что теломерный гетерохроматин как особый теломерный спейсер высоко компактизован в G1-фазе или на границе G1-фазы и S-фазы клеточного цикла и что он присоединен к участкам перимембранного ядерного матрикса, образующего так называемые "армирующие щиты", то при этом создаются условия, затрудняющие использование фонтанного механизма теми хромосомными генами, которые локализованы вблизи теломер. В указанной ситуации компактизованный теломерный хроматин мог бы играть роль своеобразного теломерного спейсера, удерживающего ближайшие перителомерные гены на безопасном расстоянии от периметра армирующего щита. Этот щит, по сути дела, создает для системы ионных фонтанов "мертвую зону", ибо здесь внутренняя ядерная мембрана не доступна для контакта с ней конвертеров, то есть участков ДНК, акцептирующих фРНК и благодаря этому участвующих в активации ионных каналов. Поэтому длина теломеры как компактизованного спейсера может стать на определенной стадии клеточного цикла важным фактором регуляции уровня экспрессии генов, ближайших к теломере. Чем теломера оказывается короче в ходе клеточного старения, тем в большей степени указанные гены оказываются втянутыми в область армирующего щита и, соответственно, тем менее они оказываются доступными для рассматриваемого механизма ионной модуляции генной активности. Продукты различных генов участвуют в работе клеточного гомеостаза, будучи объединены в многочисленные цепи межмолекулярных взаимодействий. Поэтому понижение концентрации генных продуктов, кодируемых даже относительно небольшим числом генов, например, субтеломерных генов, с неизбежностью должно отразиться в неблагоприятную сторону на работе других клеточных генов и, в целом, на гомеостатических возможностях старых клеток по сравнению с "молодыми" клетками. Постепенное укорочение теломерных спейсеров может поэтому, при прочих равных условиях, вести к постепенному уменьшению функциональных возможностей клеток, то есть приводить к клеточному старению.
В предлагаемой фонтанной системе количественной модуляции признаков клетки, которая дополняет уже известные системы внутриядерных регуляций, в равной мере важны как конвертеры, то есть сайты ДНК, фланкирующие собой гены и ответственные за связывание молекул фРНК, так и те последовательности генома, которые кодируют саму фРНК. Поскольку фРНК нужна для модуляции активности генов, последовательности, которые кодируют фРНК, обозначены здесь как гены-модуляторы, или просто модуляторы. Если в ходе эволюции многоклеточных организмов, от амебы до человека, происходят разнообразные перемещения упомянутых элементов фонтанной системы относительно их прежней локализации в хромосомах, то эти перемещения могут и должны сопровождаться изменениями количественной модуляции уровня экспрессии соответствующих генов. Если это так, то транспозоны и ретропозоны как мобильные элементы эукариотического генома могли бы получить принципиально новую функцию. Эта функция есть количественное изменение признаков клеток и организмов в целом, осуществляемое в эволюции под контролем фРНК-зависимой ионной модуляции продуктивности отдельных регионов генома.
В рамках представлений о фонтанной системе модуляции генетической активности можно предположить, что энхансеры, которые, как известно, усиливают транскрипционную активность многих генов, могли бы использовать для достижения этой цели ни что иное, как предлагаемый здесь фРНК-зависимый механизм ионной модуляции уровня экспрессии генов. В этом случае многочисленные белки, входящие в уже обнаруженные так называемые энхансеросомы, могли бы, в частности, участвовать в создании наиболее оптимальных условий для взаимодействия молекул фРНК с конвертерами с последующей организацией вблизи соответствующих генов серии кратковременно активируемых и затем закрывающихся ионных каналов.
Следует заметить, что рассматриваемая здесь РНК-зависимая ионная система модуляции эукариотического генома способна играть важную роль не только в ходе нормального индивидуального развития. Она может также вовлекаться в патогенез различных заболеваний, в том числе генетических болезней, к которым относится и рак.
Рассматриваемый здесь механизм ионной модуляции уровня экспрессии генов и его приложение к проблемам биологии клеточного старения были частично рассмотрены ранее в [33,34] и на двух конференциях - в Сан-Франциско и Гейдельберге, обе в 1998 году, посвященных роли теломер в биологии стареющих и раковых клетках. Поскольку уже доказана предсказанная мной корреляция между процессом укорочения теломер и старением клеток размножающегося клона, представляет интерес выяснение возможного причинного механизма подобной корреляции. Соответствующие предсказания и история вопроса изложены в работах [5,6,31,7,32]. Природу теломерного сигнала можно было бы понять с учетом развиваемых представлений о фонтанном механизме модуляции активности генов.
Итак, согласно фонтанному, или гейзерному, механизму модуляции активности эукариотических генов, необходимо, чтобы происходило взаимодействие молекул фРНК с конвертерами, то есть с сайтами ДНК, акцептирующими фРНК. Как может возникать такая комплементарность в ходе эволюции геномов? Где кодируются молекулы фРНК? Эти и близкие к ним вопросы рассматриваются в следующем разделе.
ГДЕ КОДИРУЮТСЯ РАЗНЫЕ МОЛЕКУЛЫ фРНК? ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ СУБТЕЛОМЕРНОЙ ДНК И МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ
Постулируемый мной новый класс малых ядерных РНК, а именно фонтанных РНК (фРНК), выполняет роль сигнальных лигандов, взаимодействующих с другими сигнальными системами ядра, количественно меняя продуктивность генов. Компоненты фонтанной системы рассеяны по хромосомам, причем сами фРНК преимущественно кодируются в субтеломерных областях, где находятся соответствующие гены-модуляторы, или просто модуляторы. Сайты ДНК, связывающие фРНК, обозначенные как конвертеры, находятся по соседству со структурными генами. Эволюционное изменение числа конвертеров вблизи любого данного гена, при прочих равных условиях, в определенных пределах пропорционально увеличивает генную продуктивность. Компоненты фонтанной системы могут находиться на фланге или флангах гена как стабильная часть хромосомной ДНК и в ходе индивидуального развития и старения распределение конвертеров по геному человека, конечно, не меняется.
Однако, конвертеры могут присутствовать в повторах транспозонов (а именно, в так называемых LTR). Одна из основных эволюционных функций транспозонов могла бы состоять в перемещении по геному конвертеров и других элементов, обеспечивающих работу фРНК-зависимого ионного механизма модуляции транскрипционной активности эукариотических генов. Мобильные элементы в этом случае получают возможность играть важную роль в эволюции, ибо адаптация в значительной мере зависит от дифференциального изменения продуктивности структурных генов и кодируемых ими количественных признаков. Мобильные элементы, перемещаясь от гена к гену, могли бы в контексте фонтанного механизма менять концентрацию генного продукта. Помимо этого, перемещение мобильных элементов по геному в ходе эволюции могло бы выполнять еще и своеобразную спейсорную функцию. Ее суть состоит в разнесении в пространстве тех ионных каналов, которые обслуживают разные гены. Если даже не производящие никаких фонтанов какие-либо транспозоны встают в качестве разделяющего спейсора между смежными генами, то этим предотвращается нежелательная интерференция ионных фонтанов, организованных возле каждого из генов. Кроме того, транспозон или ретропозон, внедряясь между фонтанным конвертером и его структурным геном дистанционно разобщает их, и это приводит к снижению транскрипционной активности гена. Мобильный элемент может также приносит с собой альтернативный конвертер, то есть конвертерную ДНК, способную акцептировать фРНК, которая будет участвовать в активации альтернативного ионного фонтана, оппозитно действующего на данный структурный ген.
Конкретный паттерн повторов данного межгенного спейсора, независимо от того сформирован он при участии транспозонов и ретропозонов или же возник за счет негомологичной рекомбинации хромосом, позволяет в эволюции менять расстояние между смежными генами в пространстве ядра за счет компактизации или декомпактизации повторов, входящих в состав данного спейсора, и при необходимости не только отдалять друг от друга неблагоприятно интерферирующие фонтаны, но и , напротив, сближать те гены, которые используют ионный "душ" в виде ионов одной и той же природы.
Количество и природа конвертеров, обрамляющие разные структурные гены могут быть неидентичными. Кроме того, конвертеры, фланкирующие с одной или обеих сторон разные гены, могут в принципе организовывать неодинаковые ионные каналы. Выбор диктуется нуклеотидной последовательностью данного конвертера. Например, вблизи одного гена активируются фРНК-зависимые Ca2+ -каналы, а вблизи другого гена фРНК-зависимые Zn2+ -каналы, создаваемые соответственно молекулами фРНК разной специфичности.
Для активации ионного канала при участии соответствующей молекулы фРНК необходимо сочетание комплекса факторов. Внутренняя ядерная мембрана, согласно предположению, несет в себе закрытые ионные каналы, потенциально способные пропускать в ядро специфические ионы. Некоторые из этих каналов являются кальциевыми, другие - цинковыми. Можно предположить также существование калиевых или некоторых других каналов у определенных объектов. Все эти каналы могут быть объектом регуляции различных, независимых от фРНК, лигандов. В то же время, молекулы фРНК, взаимодействуя с этими каналами, дают эффект, принципиально отличный от действия всех прочих возможных лигандов, которые могли бы также активировать эти каналы. Принципиальное отличие состоит в том, что молекулы фРНК обеспечивают топографическую селективность активации нужных фРНК-зависимых каналов. В отличие от прочих лигандов, специфические фРНК связываются, например, не со всеми кальциевыми каналами данного ядра, а лишь с теми из них, которые находятся вблизи, например, генов А, В, и С, расположенных на значительных расстояниях друг от друга, и даже, например, на разных хромосомах. Такая топологическая селективность обеспечивается комплементарным связыванием молекулы фРНК с конвертерной ДНК вблизи соответствующих генов.
Для того, чтобы указанное взаимодействие фРНК и конвертерной ДНК могло произойти, необходимо соблюдение следующих условий. Каждая молекула фРНК должна иметь, по крайней мере, два домена, вариабельный и константный. Вариабельный домен нужен для связывания РНК и ДНК, а константный домен, соответственно, например, кальциевый или цинковый домен, необходим для поиска и последующей активации расположенного в мембране пока еще закрытого ионного канала.
Как происходит взаимодействие вариабельного домена фРНК с комплементарным ему сайтом конвертера? Оно может происходить в принципе двумя разными способами. Первый состоит в том, что конвертерная двунитевая ДНК, взаимодействуя с внутренней ядерной мембраной, расплетается с образованием однонитевого сегмента, доступного для формирования дуплекса ДНК-фРНК. Формирование этого дуплекса приводит к конформационному изменению в константном домене фРНК, который после этого приобретает способность к взаимодействию с белком закрытого ионного канала. Указанные события могут происходить с участием вспомогательных белков, образующих рибонуклеиновый комплекс с фРНК.
Второй возможный вариант взаимодействия фРНК с ДНК конвертера, расположенного недалеко от ядерной мембраны и локализованного в хромосомной ДНК вблизи участков заякоривания петли хроматина, несущей в себе соответствующий структурный ген, может выглядеть несколько иначе. Как и в предыдущем варианте, конвертерная ДНК распознается в однонитевой форме. Однако, взаимодействует с однонитевой конвертерной ДНК особая форма фРНК, которая приобретает двунитевую структуру. Двунитевая РНК образует триплекс с однонитевой конвертерной ДНК. Возникший триплекс распознается соответствующими белками (триплеринами), которые после этого приобретают способность к специфической активации расположенных рядом закрытых ионных каналов. Ионный канал открывается на короткий срок. Продолжительность этого временного интервала , лимитируется продолжительностью конформационной перестройки, происходящей во взаимодействующих между собой белках, а именно в белке, связавшемся с триплексом, то есть в триплерине, и в белке закрытого ионного канала. В результате ионный канал обеспечивает однократную инжекцию дозированной порции определенного ион, после чего канал вновь закрывается. Преимущество этого триплексного варианта над выше упомянутом первым, то есть дуплексным, вариантом могло бы состоять в большей устойчивости триплекс-содержащего комплекса.
Для организации комплекса РНК-РНК-ДНК необходимо формирование двунитевой конфигурации РНК. Она могла бы возникать, например, за счет складывания самой молекулы фРНК. Однако, как можно предположить, возможен и еще один, на первый взгляд более сложный молекулярный сюжет. Он состоит в том, что двунитевой участок молекулы фРНК формируется за счет взаимодействия с "посторонней" молекулой РНК, которая кодируется участком ДНК, расположенным вблизи данного или другого структурного гена. Эта РНК есть ни что иное как своеобразный антисенс, комплементарный к вариабельному домену фРНК. То есть речь идет о природной антисенсной фРНК. Такое, на первый взгляд усложняющее условие, в действительности открывает дополнительные возможности для взаимодействия генов внутри эукариотического генома, создавая условия для своеобразных диалогов между разными генами и генными кластерами. В качестве источника молекул этих антисенсов, которые удобнее назвать как диалоговая РНК (дРНК), образующих дуплекс с вариабельным доменом соответствующей молекулы фРНК, могли бы, в частности, выступать те молекулы РНК, которые транскрибируются вблизи хромомеров с так называемых междисковых сегментов хромосом, транскрипция которых, например, давно документирована для политенных хромосом, хотя функция их остается не полностью проясненной. Дуплекс в виде дРНК-фРНК образует далее триплекс с однонитевым сегментом конвертерной ДНК, локализованной вблизи или в составе так называемых MAR, то есть элементов оснований петли ДНК, способной заякориваться при определенных условиях вблизи внутренней ядерной мембраны.
Образование триплекса дРНК-фРНК-ДНК может использоваться в эукариотическом геноме для двух разных, хотя и не взаимоисключающих целей. Первая цель - это формирование ионных каналов вблизи соответствующих структурных генов с целью модуляции продуктивности транскрибируемого гена. Независимо от того, как именно активируется фРНК, итогом оказывается кратковременное открывание ворот ионного канала. В зависимости от природы ионного канала и количества конвертеров и приходящих к ним молекул фРНК транскрипционную продуктивность генов в эволюции можно количественно регулировать этим своеобразным "ионным реостатом". Использование триплексов представляется более многообещающим не только по соображениям их устойчивости в комплексе с соответствующими белками, но и ввиду относительной уникальности самих триплексов, облегчающих их поиск в геноме соответствующими белками, обозначенными как триплерины. Вторая возможная цель и преимущество использования упомянутых триплексов дРНК-фРНК-ДНК состоит в маркировании флангов соответствующего гена либо генного кластера для последующей декомпактизации (либо компактизации) нужного участка хромосомы, в зависимости от природы, связанных с данным сегментом белков, а также природой ионов, которые поступают через соответствующий канал.
Этот механизм, который можно обозначить здесь как "триплексный механизм маркирования" хромосомных сегментов мог бы, как я полагаю, использоваться вообще в ходе любого клеточного цикла у эукариот в случае необходимости селективной переупаковки хроматина ради создания новых сегментов эухроматина и нового паттерна гетерохроматизации. Подобная необходимость может возникать в процессе осуществления клетками процессов клеточной дифференцировки, которые требуют для своего осуществления как раз изменения паттерна компактизации хроматина. Диалоги генов и межгенных кластеров, осуществляющиеся, в частности, посредством упомянутых дРНК, могли бы способствовать осуществлению процессов репрограммирования генома, происходящих в ходе различных клеточных дифференцировок.
Что касается источника фРНК, то они могли бы кодироваться, помимо субтеломерных регионов хромосом и LTR транспозонов, также и некоторыми другими сегментами, например, находящимися в районе ядрышковых организаторов.
Ионы кальция, диффундирующие соответственно через ф(Ca)РНК-зависимый канал, могли бы увеличивать срок жизни информационной РНК. Изменение локальных ионных концентраций могло бы влиять не только на процесс созревания мРНК и срок выживания транскриптов, но и на локальную конфигурацию хроматина.
Ионные каналы, активируемые на короткий срок при участии специфических молекул фРНК, неслучайным образом распределяются как вдоль хромосомы, так и в самой трехмерной структуре ядра, что необходимо, во-первых, для предотвращения нежелательной интерференции ионных фонтанов разной природы, и во-вторых, для обеспечения кооперации ионных каналов в тех хромосомных сегментах, которые в этом нуждаются.
Поскольку компоненты фонтанной системы взаимодействуют между собой, они должны иметь общее эволюционное происхождение. Этому, как можно предположить, способствует интеграция субтеломерных регионов в некоторые внутрихромосомные районы, а это может происходить как за счет негомологичных рекомбинаций, а также путем обратных транспозиций, связанных с внедрением в геном копий молекул фРНК, изготовленных с участием обратной транскриптазы. Что касается негомологичных рекомбинаций, то они могут происходить, например, в ходе хромосомной эволюции на фоне слияний и разрывов концов разных хромосом и последующих перемещений некоторых из прежних субтеломерных регионов в состав межгенных повторов. Подобная диверсификация создает предпосылку для взаимной комплементарности происходящих из одного источника модуляторов (то есть последовательностей, кодирующих фРНК), конвертеров (то есть последовательностей, акцептирующих молекулу фРНК) и междисковых сегментов, кодирующих, в частности, дРНК (дРНК комплементарна вариабельному домену фРНК, который, в свою очередь, комплементарен конвертерной ДНК).
ПОЧЕМУ МНОГИЕ ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ ИМЕЮТ ЦИНКОВЫЕ ПАЛЬЦЫ? НЕЛЬЗЯ ЛИ ОБЪЯСНИТЬ АКТИВНОСТЬ ЭНХАНСЕРОВ, САЙЛЕНСЕРОВ И ИНСУЛЯТОРОВ В РАМКАХ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О ФОНТАННОМ МЕХАНИЗМЕ ?
Итак, фонтанный механизм, то есть фРНК-зависимая ионная регуляция свойств хроматина и внутриядерной экспрессии генов, действует как своеобразный ионный реостат, способный в зависимости от числа конвертеров вблизи гена и других обстоятельств количественно менять в эволюции особенности признаков клеток и организмов. Индивидуальные эукариотические гены при каждом данном цитофенотипе нуждаются в строго определенном ионном окружении. Приняв указанные утверждения, можно по-новому объяснить некоторые особенности энхансеров, сайленсеров и инсуляторов, а также некоторые свойства ядерных белковых факторов.
Известно, что ионы Mg2+ и Ca2+ распределены вдоль хромосом неравномерно [24]. Многочисленные исследования указывают на возможную роль ионов в активности генов. В частности, Крегер и другие указали на возможность регуляции процесса пуффирования политенных хромосом под воздействием некоторых ионов и гормонов [21-23,9,25,3]. Найдены также доказательства существования во внутренней ядерной мембране Ca2+ каналов, которые могут активироваться инозитол-трифосфатом или cADP-рибозой [35]. Longin и другие [26] не только наблюдали присутствие кальциевых и цинковых каналов в ядре, но и показали их способность открываться и закрываться на короткие интервалы в пределах около 4-5 ms, причем эти каналы были нечувствительны к некоторым известным блокаторам ионных каналов. Longin с соавторами подчеркнули, что роль обнаруженных ими каналов остается неизвестной. Ca2+ каналы найдены также в работе [27]. Перинуклеарная цистерна ядерного конверта имеет сравнительно небольшой объем, но он увеличивается, если возрастает метаболическая активность ядра [4]. Структура и функции ДНК меняются в зависимости от ионного окружения [18]. Ca2+ может увеличивать транскрипционную активность и стабильность мРНК [10].
Многие ядерные белки имеют цинковые пальцы. Известно, что участие ионов цинка может сильно увеличивать прочность образующихся макромолекулярных комплексов, однако, некоторые из белков обходятся без ионов цинка, используя, например, соответствующие физико-химические особенности лейцина или прибегая к другим факторам. Некоторые транскрипционные белки имеют лейциновые застежки-молнии [29]. Цинковые пальцы используются в белках и вне ядра. Я выдвигаю предположение, что поразительно широкое использование ионов цинка компонентами транскрипционных комплексов обусловлено прежде всего тем, что ион цинка мог бы легко использоваться фонтанным механизмом для регуляции процессов транскрипции. Известно, что ядерные гормональные рецепторы составляют большую семью транскрипционных факторов, обладающих цинковыми пальцами.
Локальный дефицит цинковых ионов, как и их дозированный избыток, могли бы, по-видимому, радикальным образом менять транскрипционную активность того или иного гена. Имея в своем распоряжении по меньшей мере два разных иона и варьируя вблизи генов содержание кальция и цинка, клетка получает возможность неслучайным образом и на альтернативной основе усиливать или тормозить активность соответствующих структурных генов. Используются ли при этом еще и другие ионные каналы, такие как гипотетический фРНК-зависимый калиевый канал, предстоит выяснить экспериментально.
В связи с этими обстоятельствами любая эукариотическая клетка получает возможность манипулировать активностью генов с помощью так сказать своеобразного "ионного кода". В зависимости от природы конвертеров, необходимых для формирования того или иного ионного канала вблизи данного структурного гена, и в зависимости от специфичности белков хроматина, связанных с данным сегментом хромосомы, изменение локального ионного окружения может и неизбежно должно вести к неслучайным и противоположно направленным изменениям в конфигурации хроматина, доступности локализованных в нем генов и их продуктивности. При прочих равных условиях, например, гены А и В, фланкированные разным количеством одинаковых конвертеров, будут иметь разную продуктивность. Допустим теперь, что цинковые ионы активируют те участки хроматина, в которых локализованы гены А и В, тогда как кальциевые ионы оказывают противоположный эффект. В соответствии с этим, потеря геном А в ходе эволюции цинк-специфичного конвертера и приобретение кальций-специфичного конвертера будет вести к ослаблению количественного признака, кодируемого этим геном А. Для какого-либо одного гена оптимальным будет "ионный код" в виде одних только кальциевых конвертеров, то есть конвертеров, связывающих лишь ф(Ca)РНК. "Ионный код" другого гена или генного кластера - это обладание только цинковыми конвертерами. Третий вариант "ионного кода" - это обладание смесью кальциевых и цинковых конвертеров. Если бы в фонтанной системе могли бы использоваться также и калиевые конвертеры, это дополнительно увеличивало бы разнообразие возможных комбинаций ионных конвертеров, фланкирующих те или иные сегменты генома.
Уместно отметить, что была продемонстрирована способность некоторых регионов сателлитной ДНК формировать комплексы с РНК, причем такие комплексы были необычно резистентны к нуклеазам [28], что заманчиво сопоставить с возможностью повышенной резистентности к нуклеазам постулированных выше триплексов дРНК-фРНК-ДНК, соединенных с белком-триплерином. Имеются также свидетельства в пользу прочной ассоциации некоторых молекул РНК с ядерной мембраной [28,15], что также не противоречит предположению об интеграции молекул фРНК в комплекс, взаимодействующий с канальными белками внутренней мембраны ядра. Следует подчеркнуть, что работа фонтанного механизма может быть эффективна только при условии, что регулирующие нуклео-цитоплазматический транспорт ядерные поровые комплексы отсутствуют или закрыты вблизи работающих фРНК-зависимых ионных каналов. В этой связи уместно отметить, что ворота ядерных поровых комплексов способны обратимо закрываться [19], что при определенных условиях могло бы предотвращать вхождение через ядерный поровый комплекс любых посторонних ионов, препятствующих нормальной работе фонтанного механизма.
В контексте работы фонтанного механизма ионной модуляции эукариотических генов представляется возможным по-новому рассмотреть принцип работы таких генетических элементов, как энхансеры, сайленсеры, инсуляторы и MAR"ы. Они могут оказаться ничем иным как компонентами фонтанной системы модуляции уровней экспрессии генов у эукариот. Можно допустить, что в основе работы энхансеров, способных усиливать транскрипцию того или иного структурного гена, лежит обладание определенным конвертером (или кластером из конвертеров), способным связывать те молекулы фРНК, которые нужны для усиления работы данного структурного гена. Если принять, что энхансеры действительно являются участниками фонтанной системы регуляции эукариотического генома, то становится понятной ранее загадочная потребность во взаимодействии далеко отстоящего энхансера с промотором для того, чтобы энхансер мог начать оказывать свое усиливающее действие в отношении транскрипционной активности данного структурного гена. Что собственно происходит при таком взаимодействии, требующим участия многих регуляторных белков, составляющих энхансеросому? Мой ответ состоит в том, что это необходимо в основном для главной, если не единственной, цели - для физического подтягивания конвертеров этого энхансера как можно ближе к данному гену. В том случае, если такое взаимодействие происходит вблизи внутренней ядерной мембраны, то зависимые от этих энхансерных конвертеров ионные каналы окажутся доступными для соответствующего структурного гена. Разумеется, если аналогичное взаимодействие энхансера и промотора происходит в срединной части ядра, и энхансерные конвертеры не могут дотянуться до внутренней ядерной мембраны, то в такой ситуации предлагаемый механизм работы энхансера себя проявлять принципиально не может.
Если принять предлагаемое объяснение относительно энхансеров, то становится понятной и роль инсуляторов. Как известно, сравнительно короткие инсуляторные последовательности, если они находятся между энхансером и промотором, способны предотвращать формирование комплекса энхасера с промотором и не позволяют энхансеру усиливать работу соответствующего структурного гена. В контексте фонтанного механизма этот эффект блокирования энхансерной активности инсулятором объясняется невозможностью физически подтянуть конвертер(ы) данного энхансера к соответствующему структурному гену, когда ген находится вблизи внутренней мембраны ядра. Элементы прикрепления хроматина вблизи внутренней ядерной мембраны, то есть MAR-элементы, помогают вместе с тем также и закреплению конвертеров вблизи внутренней ядерной мембране. В этой связи следует заметить, что при определенных условиях структурный ген может пользоваться услугами по сути дела двух разных вариантов конвертеров - как собственных конвертеров, непосредственно фланкирующих его, так и тех конвертеров, которые ему приносит энхансер во "временный подарок".
Обзор ранней литературы о роли ионов как возможных регуляторов генов дан в работах [3,36,10]. Следует особо подчеркнуть, однако, что использование в качестве лигандов, открывающих ионные каналы именно молекул РНК, как это предлагается в фонтанной модели, открывает принципиально новые возможности весьма гибкого модулирования активности разных генов, чего лишены любые другие лиганды, такие как инозитол-трифосфат, экдизон и другие гормоны и прочие факторы, не способные распознавать специфические последовательности ДНК, в отличие от таких лигандов, как фонтанная РНК.
Полиморфизм микросателлитов и минисателлитов играет определенную, хотя все еще не объясненную роль в экспрессии многих генов, причем каждый аллеломорфный вариант этих генов имеет умеренный эффект в отношении данного фенотипа. Большинство количественных признаков контролируется не одной какой-то последовательностью, а с участием сложных наборов сателлитной ДНК [11]. В рассматриваемом контексте, указанный полиморфизм можно было бы истолковать как обладание указанными здесь компонентами фонтанной системы.
ФОНТАННЫЙ МЕХАНИЗМ И ПАТОЛОГИЯ
Фонтанный механизм наделен способностью модулировать количественные признаки, такие как темп роста, вес и высота тела, кровяное давление и т.п. В рассматриваемом контексте представляет интерес факт существования корреляции между вариабельными числами тандемных повторов и тяжестью некоторых заболеваний [30,16,20]. Пониженные темпы роста у детей и малый рост у их родителей коррелирует со значительным уменьшением количества C-гетерохроматина в субтеломерных и перицентромерных регионах [8]. Течение некоторых мультигенных болезней, в том числе и рака, частично может быть понято как особенности функционирования количественных признаков клеток [13]. Многие раковые клетки отличаются не только по специфическим мутациям структурных генов, но и по своим количественным признакам.
Известно, что при некоторых болезнях экспрессия генов находится под контролем так называемых модифицирующих локусов, или полигенов [17,12]. Возможно, что полигены как раз и являются членами фонтанной системы модуляции эукариотического генома.
Cледует заметить, что патология многих вирусных болезней могла бы отчасти в своих проявлениях зависеть от активности кодирующих фРНК модуляторов и конвертеров. Повышенная и пониженная резистентность или чувствительность разных людей к одной и той же инфекции может, среди прочих факторов, базироваться на уровнях экспрессии заинтересованных генов, а эти уровни как раз и контролируются доступностью для соответствующих генов конвертеров и других элементов фонтанного механизма. Это может быть верно для способности организма противостоять различным инфекциям, в том числе и таким как вирус иммунодефицита.
Если компоненты фонтанной системы действительно важны не только в норме, но и при патологии, то они могут стать потенциальными мишенями для соответствующей лекарственной терапии.
ФОНТАННЫЙ МЕХАНИЗМ И УКОРОЧЕНИЕ ТЕЛОМЕР
На определенной стадии клеточного цикла, например, при переходе от G1- к S-фазе высоко конденсированный теломерный гетерохроматин может играть роль спейсера, позволяющего субтеломерным генам избежать приближения к так называемой "мертвой зоне". Она соответствует тому участку околомембранного ядерного матрикса, так называемого армирующего щита, к которому прикрепляются на противоположных полюсах ядра хромосомные теломеры и центромеры. Будучи плотно упакованными в соответствующие периоды клеточного цикла, теломеры и центромеры могли бы обеспечивать поддержание определенного расстояния между ионными "мертвыми зонами" и ближайшими генами. "Мертвые зоны" обозначены так потому, что в этих местах липидная мембрана ядра, будучи прикрыта армирующими щитами, недоступна для образования в ней фРНК-зависимых ионных каналов. Лишь те гены, которые находятся далеко от этих щитов, могут подвергаться оптимальной фРНК-зависимой ионной модуляции их экспрессии. Чрезмерное укорочение гетерохроматинизированных теломерных спейсеров подтягивает субтеломерные гены слишком близко к "мертвой зоне", и это видоизменяет нормальную активность субтеломерных генов. Поэтому, не имея больше доступа к ионным фонтанам за переделами периметра армирующего щита, соответствующие гены вынуждены менять свою активность при чрезмерном укорочении теломеры. В этом смысле ионные "мертвые зоны" выступают как своеобразный эпигенетический фактор. Искусственное удлинение теломерных спейсеров может предотвращать втягивание генов в область "мертвой зоны" и потому способно, при прочих равных условиях, предотвращать развитие тех признаков стареющей клетки, если они обусловлены теломера-зависимым старением. Ввиду взаимодействия, по крайней мере, некоторых генных продуктов между собой, изменение продуктивности некоторых из генов, обусловленное эффектом укорочения теломеры, нарушает нормальную работу клеточного гомеостаза и ведет к снижению резистентности клеток к возмущающим воздействиям, то есть к клеточному старению.
Таким образом, в контексте представлений о фонтанном, то есть фРНК-зависимом ионном регулировании продуктивности генов эукариотических клеток, можно объяснить предсказанную ранее корреляцию между предсказанным ранее процессом укорочения теломер [5,6,31,32] в делящихся нормальных соматических клетках человека и животных, с одной стороны, и формированием признаков старения в этих клетках.
Эффекты положения, наблюдаемые в генах, изменяющих свою активность при приближении гена к теломере или центромере, являются обратимыми [37]. Некоторые из эффектов положения можно было бы объяснить субоптимальным ионным окружением, что обусловлено локальной недоступностью ионных каналов или присутствием ионного окружения, оказывающего компактизующий эффект в отношении данного сегмента хроматина.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Старение многоклеточного организма, в том числе старение организма человека, и старение клеток отличаются от старения делящихся клеток в культуре ткани, по крайней мере, в двух отношениях. Старение организма есть, безусловно, системный процесс, базирующийся на взаимодействии стареющих клеточных ансамблей, из которых состоит организм. Каждый из этих ансамблей может отличаться по темпам и признакам старения. Не вызывает сомнения, что многие делящиеся в организме клетки, например, фибробласты человека, не успевают за человеческую жизнь полностью исчерпать свой лимит Хейфлика. И в этом смысле этот лимит, при всей его абсолютной достоверности, является лабораторным феноменом. Этим его значение для геронтологии, впрочем, ни в коей мере не снижается, уже по одному тому, как сильно исследование этого феномена продвинуло вперед наше понимание механизмов клеточного старения. Тем не менее, остается весьма актуальным вопрос о том, что же является движущими силами старения тех клеточных ансамблей, которые не делятся во взрослом организме человека. Многочисленные данные свидетельствуют в пользу того, что старение организма человека и животных в значительной степени, если не в основном, связано со старением нейроэндокринных функций головного мозга, по поводу чего существует огромная литература. В контексте рассматриваемых в предлагаемой работе представлений о роли теломер и фонтанного механизма регуляции эукариотических генов неизбежен вопрос о том, можно ли привлечь эти механизмы к объяснению старения постмитотических нейронов головного мозга. Ведь эти клетки не пролиферируют и потому постулированный мной ранее процесс концевой недорепликации ДНК на концах хромосом, то есть в теломерах [5], к ним в принципе не применим. Означает ли это, что процесс концевого недокопирования ДНК поэтому не может быть привлечен для истолкования процессов старения неделящихся нейроэндокринных клеток мозга? Возможный ответ на этот вопрос предложен мной в работе 1992 года [7], где была предложена идея концевой недорепарации ДНК. Постулированный процесс неполного копирования конца ДНК должен проявлять себя как в делящихся, так и в постмитотических клетках по той причине, что ДНК-полимераза репаративного синтеза, подобно ДНК-полимеразе репликативного синтеза, не может заполнить концевую брешь на 5'-конце реплики ввиду отсутствия свободного 3'-конца, который способна наращивать ДНК-полимераза репаративного синтеза. Поэтому все те факторы, например, свободные радикалы, которые ведут к появлению соответствующих концевых брешей, должны с неизбежностью вести к укорочению концов двойной спирали ДНК даже и в постмитотических клетках. Поэтому, укорочение молекулы ДНК возможно и, например, в нейроэндокринных клетках мозга человека. Чрезмерное укорочение соответствующих буферных последовательностей ДНК, каковыми являются теломеры, может вести к соответствующим изменениям активности нейроэндокринных и других клеток, как делящихся, так и неделящихся. Возраст-зависимое нарушение нормальной продуктивности различных клеточных ансамблей, интегрированных в единый организм, приводит к ухудшению условий работы даже для тех клеточных ансамблей, которые еще сохранили в своих клетках достаточную длину той теломерной буферной ДНК, которая защищает собой расположенные вслед за ней информационно важные последовательности. В этом как раз и сказывается системный характер организменного старения. Я хотел бы предложить здесь следующую формулировку относительно процессов старения, независимо от того, происходят ли они на уровне организма или в отдельных клетках. Старение есть универсальная генетическая "болезнь количественных признаков". Сведения, добываемые цитогеронтологией на индивидуальных клетках и факты, полученные при исследовании организма как целого согласно говорят о том, что в ходе старения человека и животных не происходит экспрессии принципиально новых макромолекул. Все, что происходит при старении, этой все еще неизбежной универсальной генетической болезни, это именно не качественное, а количественное изменение различных признаков, число которых огромно. В качестве простой иллюстрации достаточно вспомнить возраст-зависимое изменение сердечно-сосудистой системы, иммунной системы, мышечной силы, уменьшение емкости легких, увеличение размера ядер в стареющих фибробластах, и т. д., и т. п. Если старение есть действительно болезнь количественных признаков, то уместно в рамках биогеронтологических исследований обратиться именно к тем ключевым молекулярным механизмам, которые лежат в основе регуляции у эукариот именно количественных признаков. Согласно рассмотренной в настоящем сообщении концепции, количественные признаки модулируются фРНК-зависимым ионным механизмом, или кратко фонтанным механизмом, модулирующим продуктивность генов у эукариот. Высшие животные и человек приобрели много преимуществ благодаря фонтанной системе модуляции работы генов, но они и платят за это тем, что страдают от болезней, не известных в прокариотическом мире.
Выполнение этой работы частично поддержано грантом РФФИ 98-04-48654
Список литературы
1. Дильман В.М. Старение, климакс и рак. - Л., Медицина, 1968.
2. Дильман В.М. Большие биологические часы. - М., Знание, - 1981.
3. Жимулев И.Ф. Политенные хромосомы: морфология и структура. Новосибирск. Изд-во Наука. 1992.
4. Збарский И.Б. Организация клеточного ядра. Москва. Изд-во Медицина. 1988.
5. Оловников А.М. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. // Доклады АН СССР.- 1971.- Т. 201, - С. 1496-1499.
6. Оловников А.М. Иммунный ответ и процесс маргинотомии в лимфоидных клетках. // Вестник АМН СССР.- 1972. - ? 12, - С. 85-87.
7. Оловников А.М. Старение есть результат укорочения "дифферотены" в теломере из-за концевой недорепликации и недорепарации ДНК. // Известия АН СССР, Серия биол. - 1992., ? 4, - С. 641-643.
8. Подугольникова О.А., Бурая Т.И., Солониченко В.Г. Цитогенетические исследования функций вариабельных районов С-гетерохроматина человека. II. С-гетерохроматин в семьях с наследственной малорослостью. // Цитология. - 1994. - Т. 36, - C.1041-1048.
9. Ashburner M, Cherbas P: The control of puffing by ions-the Kroeger hypothesis: A critical review. Mol Cell Endocrinol ;1976; 5:89-107.
10. Bartlett JD, Luethy JD, Carlson SG, et al.: Calcium ionophore A23187 induces expression of the growth arrest and DNA damage inducible CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP)-related gene, gadd153. Ca2+ increases transcriptional activity and mRNA sta-bility. J Biol Chem 1992; 267:20465-20470.
11. Comings DE: Polygenic inheritance and micro/minisatellites. Mol Psychiatry 1998;3:21-31.
12. Сullen P, Funke H, Schulte H, et al.: Lipoproteins and cardiovascular risk-from genetics to CHD preven-tion. J Atheroscler Thromb 1997;4:51-58.
13. Devereux TR, Kapan NL: Use of quantitative trait loci to map murine lung tumor susceptibility genes. Exp Lung Res 1998;24:407- 417.
14. Dilman V.M. Development, aging and disease. A new rationale for an intervention strategy. Harwood Academic Publ., 1994.
15. Feiferman I, Pogo AO: Isolation of a ribonucleoprotein network that contains heterogenous RNA and is bound to the nuclear envelope. Biochemistry 1975;14:3808-3816.
16. Heringa J: Detection of internal repeats: How com-mon are they? Curr Opin Struct Biol 1998; 8:338-345.
17. Houlston RS, Tomlinson IP: Modifier genes in hu-mans: Strategies for identification. Eur J Hum Genet 1998; 6:80-88.
18. Jayaram B, Beveridge DL: Modeling DNA in aque-ous-solutions-theoretical and computer-simulation studies on the ion atmosphere of DNA. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1996;25:367-394.
19. Kiseleva E, Goldberg MW, Allen TD, et al.: Active nu-clear pore complexes in Chironomus: Visualization of transporter configurations related to mRNP export. J Cell Sci 1998;111 (Pt. 2):223-236.
20. Kornman KS, di Giovine FS: Genetic variations in cytokine expression: A risk factor for severity of adult periodontitis. Annals of Periodontology 1998;3:327-338.
21. Kroeger H: Chemical nature of the system controlling gene activities in insect cells. Nature 1963;200:1234-1235.
22. Kroeger H, Troesch W: Influence of the explanation milieu on intranuclear [Na], [K], and [Mg] of Chironomus thummi salivary gland cells. J Cell Physiol 1974;83:19-25.
23. Kroeger H: The control of puffing ions: A reply. Mol Cell Endocrinol 1977;7:105-110.
24. Levisetti R, Chabala JM, Gavrilov K, et al.: Advances in high-resolution SIMS studies of brdu-labeled hu-man metaphase chromosomes. Cell Mol Biol 1996;42:301-324.
25. Lezzi M, Richards G: Salivary glands. Ecdysone, in: Koolmam J (ed): Chemistry to Mode of Action. Stuttgart: Georg Thieme, 1989.
26. Longin AS, Mezin P, Favier A, et al.: Presence of zinc and calcium permeant channels in the inner membrane of the nuclear envelope. Biochem Biophys Res Commun 1997; 235:236-241.
27. Lui PP, Kong SK, Tsang D, et al.: The nuclear enve-lope of resting C6 glioma cells is able to release and uptake Ca2+ in the absence of chemical stimulation. Pfluegers Arch 1998;435:357-361.
28. Markova D, Donev R, Patriotis C, et al.: Interphase chromosomes of Friend-S cells are attached to the matrix structures through the centromeric/telomeric re-gions. DNA Cell Biol 1994;13:941-951.
29. Muhle-Goll C, Gibson T, Schuck P, et al.: The dimerization stability of the HLH-LZ transcription protein fam-ily is modulated by the leucine zippers: A CD and NMR study of TFEB and c-Myc. Biochemistry 1994:33:11296-11306.
30. Nakamura Y, Koyama K, Matsushima M: VNTR (variable number of tandem repeat) sequences as transcriptional, translational, or functional regulators. J Hum Genet 1998;43:149-152.
31. Olovnikov AM: A theory of marginotomy: The in-complete copying of template margin in enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon. J Theor Biol 1973;41:181-190.
32. Olovnikov AM: Telomeres, telomerase, and aging: Origin of the theory. Exp Gerontol 1996; 31:443-448.
33. Olovnikov AM: Towards the quantitative traits regu-lation: Fountain theory implications in comparative and developmental biology. Int J Dev Biol 1997;41:923-931.
34. Olovnikov AM: The telomere shortening signal may be explained by a fountain mechanism modulating the expression of eukaryotic genes. J Anti-Aging Medicine 1999; 2:57-71.
35. Petersen OH, Gerasimenko OV, Gerasimenko JV, et al.: The calcium store in the nuclear envelope. Cell Cal-cium 1998;23:87-90.
36. Vanden Broeck J, De Loof A, Callaerts P: Electrical-ionic control of gene expression. Int J Biochem 1992:24: 1907-1916.
37. Zakian VA: Structure, function, and replication of Saccharomyces cerevisiae telomeres. Annu Rev Genet 1996;30:141-172.
