Новый метод получения высокоочищенного белка p32 бактериофага т4 для биомедицинских исследований Medline.ru - медико-биологический информационный портал Медлайн.ру

Новый метод получения высокоочищенного белка p32 бактериофага т4 для биомедицинских исследований

Н.В. Зырина, Л.А.Железная, И.В. Свадьбина, Н.И. Матвиенко*

Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, тел. (495) 632-78-69. E-mail: office@iteb.ru

*- Учреждение Российской академии наук Институт белка РАН, 142290, г. Пущино Московской обл. Институтская, 4,

Резюме
В настоящее время для биомедицинских исследований широко используются различные методы амплификации нуклеиновых кислот. Однако при амплификации ДНК часто возникает проблема появления неспецифических продуктов. Применение в реакциях амплификации ДНК белков, связывающихся с оцДНК (белков SSB - single-stranded DNA binding) бактериофага T4 и E.coli, часто приводит к решению этой проблемы. В связи с этим актуальной является задача получения высокоочищенных препаратов SSB белков, свободных от примесей ДНК и нуклеаз. Мы разработали новый метод получения высокоочищенного белка SSB (T4gp32) из сконструированного нами штамма-суперпродуцента. Особенностью разработанного нами метода выделения белка T4gp32 является обработка клеточного лизата спермином для освобождения препарата от примесей нуклеиновых кислот и применение на последующих этапах очистки белка хроматографией на гепарин-сефарозе, что позволило получить препарат с чистотой более 99% свободный от экзо-и эндонуклеазных активностей.

Ключевые слова
неспецифическая амплификация ДНК, выделение рекомбинантного белка T4gp32

(статья в формате PDF. Для просмотра необходим Adobe Acrobat Reader)

открыть статью в

новом окне

Список литературы

1 Walker G.T., Linn C.P. // Clin. Chem. 1996. V. 42. P. 1604-1608.

2 Lizardi P.М., Huang X., Zhu, Z., Bray-Ward P., Thoмas D. C., Ward D. C. // Nature Genetics 1998. V. 19. P. 225-232.

3 Vincent M., Xu Y., Кong H. // EМBO report. 2004 V. 5. P. 795 - 800.

4 Tan E., Erwin B., Dames, S., Voelkerding K., Niemz A. // Clin. Chem. 2007. V. 53. P. 2017- 2020.

5 Chou Q., Russell M., Birch D.E., Raymond J., Bloch W. // Nucl. Acids Res. 1992. V. 20. P. 1717–1723.

6 Inoe J., Shigemore Y., Mikava T. // Nucl. Acids Res. 2006. V. 34. e69.

7 Schwarz K., Hansen-Hagge T., Bartram C. // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 1079-1080.

8 Sandhu D.K., Keohavong P. // Gene. 1994. V. 144. P. 53-58.

9 Villalva C., Touriol C., Seurat P., Delsol G., Brousset P. // BioTechniques. 2001. V. 31. P. 81- 86.

10 Alberts, B., Frey, L. // Nature. 1970. V. 227. P.1313 – 1318.

11 Bittner, М., Bruce, R. L, Alberts, B. М. // J. Biol. Chem. 1979.V. 254. P. 9565 – 9572.

12 Price, P. A., Lin T-Y., Stain, W., H., Мoore, S. // J. Biol. Chem. 1969. V. 244. P. 917 – 923.

13 Hosodа J., Taкacs B., Bracк C. // FEBS lett. 1974. V. 47. P. 338 – 342.

14 Мoise H., Hosodа J. // Nature. 1976. V. 259. P. 455 – 458.

15 De Walt B. W., Мurphy J. C., Fox G. E., Willson R. C. // Protein Expression and Purification. 2003. V. 28. P. 220 – 223.

16 Sellmann E., Schroder K-L., Knoblich I-M., Westermann P. // J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 4350-4355.

17 Матвиенко Н. Н., Крамаров В. М., Железная Л. А., Матвиенко Н. И. // Биохимия. 1993. V. 58. P. 1137-1149.

18 Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. (Maniatis T., Fritsch E.E., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold spring harbor laboratory, 1982.)

19 Laemmli U. R. // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

20 Кrisch H. М., Selzer G. B. // J. Мol. Biol. 1981. V. 148. P. 199 – 218.

21 Shamoo Y., Adаri H., Кonigsberg W. H., Wiliams К. R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 8844 – 8848.

22 Novagen. pET Мanual. TB055, 10th edition 2002.

23 von Hippel P.H., Кowalczyкowsкi S. C., Lonberg N., Newport J. W., Paul L. // J. Мol. Biol. 1982. V. 162. P. 795 – 818.

24 Welker E., Varadi A. // Biochem. and Biophys. Research Communications. 2000. V. 271. P. 534-536.