Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Введение
В наших предыдущих работах [2] на модели острой критической сегментарной интестинальной ишемии у крыс была показана возможность коррекции губительного каскада реперфузионных расстройств в стенке кишки перфтораном, введенным на этапе ишемии в системный кровоток. Опираясь на литературные данные о механизмах противоишемического действия перфторуглеродных эмульсий в кровеносном русле [3, 4, 8, 9, 10, 11, 12 и др.], а также на современные представления о патогенезе ишемических и реперфузионных расстройств, мы рассматривали перфторан в этом аспекте не с традиционных позиций лишь переносчика кислорода, а скорее как препарата, обладающего рядом негазотранспортных, и в первую очередь реологических, свойств. Для расширения представлений о механизмах противоишемического действия перфторана нами была поставлена цель: изучить эффекты этого препарата в микроциркуляторном русле брыжейки тонкой кишки крыс на модели полной критической интестинальной ишемии-реперфузии.
Материалы и методы
Эксперименты по изучению микроциркуляции в брыжейке были проведены на половозрелых беспородных белых крысах-самцах массой от 220 до 300г. Общую анестезию производили внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (нембутала) в дозе 5-7 мг/ 100 г массы тела. АД регистрировали посредством катетера, установленного в левой бедренной артерии. Перфторуглеродную эмульсию "Перфторан" (ОАО НПЦ "Перфторан", Пущино) или физиологический раствор хлорида натрия 0,9% вводили в правую внутреннюю яремную вену крыс в дозе 0,4-0,5 мл/100 г массы тела (6-7% ОЦК). Предварительной оксигенации (барботажа) перфторуглеродной эмульсии не проводили, в ходе эксперимента крыса дышала атмосферным воздухом через трахеостомическую трубку.
Рис. 1. Изучаемая феноменология поведения лейкоцитов в микроциркуляторном русле: роллинг, плотная адгезия, трансмиграция в венуле диаметром 50 мкм. Биомикроскопия. Ув.252х. Отметка-20 мкм.
1 - "катящийся" по стенке венулы лейкоцит
2 - лейкоцит, плотно адгезированный к стенке венулы
3 - трансэндотелиальная миграция лейкоцита в периваскулярное пространство
4 - тучная клетка без признаков дегрануляции
Наблюдение за функционированием микроциркуляторного русла (МЦР) брыжейки тонкой кишки проводили в условиях проходящего света на микроскопе МБИ-15, снабженным фоторегистрацией. Изучение феноменологии лейкоцит-эндотелиальных взаимодействий (рис.1) проводили в капиллярах и венулах до 150-200 мкм, располагающихся в лишенных жировой клетчатки "окнах" брыжейки. Измерение диаметра "питающих" артерий брыжейки проводили методом расщепления изображения в модификации П.Н. Александрова и А.М. Чернуха (1972) [1]; сигнал, пропорциональный наружному диаметру сосуда, регистрировали на самописце одновременно с кривой системного АД. Для регистрации линейной скорости кровотока в "питающих" артериях брыжейки тонкой кишки у крыс нами применен ультразвуковой допплеровский метод (электронная система и миниатюрные датчики были разработаны и сконструированы Д. Д. Мациевским [7]). Объемная скорость кровотока в "питающих" артериях брыжейки диаметром 50-400 мкм (рис.2) была оценена исходно и через 1, 5, 10, 15 и 30 минут после введения в кровоток растворов по формуле:
BF=((FV*1000) * ( рR2/4))/1000000,
где BF - объемная скорость кровотока (нл/с), FV - линейная скорость кровотока (мм/с), R - радиус наружного контура сосуда (мкм).
Статистическую обработку данных производили с использованием критерия Стьюдента.
Рис. 2. "Питающие" артерии брыжейки ("feeding" arteries) 150-250 мкм, измеряемые методом расщепления изображения. Биомикроскопия. Ув. 22х. Отметка - 200 мкм.
1 - "питающая" артерия
2 - соответствующая венула
3 - стенка кишки
Результаты исследований. В ходе экспериментов по изучению объемно-скоростных характеристик тока крови по "питающим" сосудам брыжейки эффекты введения перфторана и физиологического раствора характеризовали как величину кровотока в каждый соответствующий период в процентах от его исходного значения (табл. 1, рис. 3).
Таблица 1. Исходные значения артериального давления (АД, мм.рт.ст), диаметра "питающих" артерий брыжейки (D, мкм), линейной скорости кровотока (FV, мм/с) объемной скорости кровотока (BF, нл/с); динамика изменений объемной скорости кровотока (%BF, в % от исходных значений), (M+m, для исходной BF - min, max). Интактные животные после введения 1,0 мл перфторана или физиологического раствора.
n - количество животных; ПФ - перфторан; ФР - физиологический раствор
* - р<0,05, ** - p<0,01 (внутри группы относительно исходных показателей BF)
Рис. 3.
На фоне стабильных показателей АД показано, что сразу после введения перфторана и физиологического раствора к 1-й минуте происходит кратковременное увеличение кровотока в артериях, объемная скорость которого к 5-й минуте возвращается к исходному уровню и в последующем конкордантно снижается в обеих группах, составляя через 25-30 минут после введения примерно половину от исходной. При этом существенных межгрупповых отличий нами отмечено не было.
Рис. 4. Схема, иллюстрирующая принцип регионарной мезентериальной перфузии перфтораном - реперфузии собственной кровью с помощью оригинального "шунта"
1 - левая общая сонная артерия
2 - место наложения на "шунт" окклюдера
3 - магистраль "тройника" для подачи в мезентериальное русло перфторана
4 - краниальная брыжеечная артерия
5 - левая бедренная артерия (регистрация АД)
Для изучения возможного влияния перфторана на процессы, происходящие в микроциркуляторном русле брыжейки, был сконструирован специальный "шунт" позволяющий проводить регионарную перфузию мезентериального бассейна попеременно перфтораном и собственной кровью животного из левой общей сонной артерии (рис. 4). В ходе нескольких минут регионарной перфузии тонкой кишки 2,5-3,0 мл перфторана было отмечено постепенное "отмывание" от форменных элементов различных отделов МЦР. При перфузии перфтораном, а в последующем и при возобновлении кровотока по "шунту" в "окнах" брыжейки каких-либо структурно-функциональных нарушений МЦР в виде спазмированных артериол, стазов, тромбозов и кровоизлияний зарегистрировано не было. При биомикроскопии с большим увеличением не было выявлено признаков лейкоцитарной инфильтрации брыжейки и дегрануляции тучных клеток. Как правило, форма, расположение и размеры клеточных структур, а также интенсивность и характер лейкоцит-эндотелиальных взаимодействий видимых изменений не претерпевали. Степень функционирования различных отделов МЦР брыжейки тонкой кишки до, во время и после регионарной перфузии краниальной брыжеечной артерии перфтораном оставалась в целом неизменной.
Обсуждение
В клинических исследованиях неоднократно указывается на "улучшение микроциркуляции" при введении перфторана в регионарное и системное кровеносное русло. В ряде работ подчеркивается эффективный микрогемодинамический эффект небольших доз перфторана (2-8 мл/кг массы тела) при острой массивной кровопотере в результате улучшения условий гемоциркуляции, ликвидации спазма периферического русла, уменьшения отека эндотелия микрососудов, снижения вязкости цельной крови, повышения эластичности форменных элементов крови, уменьшения индекса агрегации эритроцитов [5, 6, 8]. Результаты ранее проведенных нами экспериментов [2] косвенно указывают на наличие у перфторана реологических эффектов и эндотелий-протекторных свойств, что не противоречит литературным данным [3, 8, 9, 10].
Благодаря уникальному методическому приему, в наших экспериментах оказалось возможным прижизненно определять объемную скорость кровотока в микрососудах до 50-400 мкм. Эксперименты на интактных животных с использованием ультразвукового допплеровского метода позволяют судить об отсутствии существенных межгрупповых различий в объемной скорости кровотока на фоне введения гемодинамически незначимых количеств перфторана (6,2% ОЦК) в сравнении с физиологическим раствором (табл. 1). Результаты экспериментов с регионарной перфузией перфтораном и реперфузией кровью тонкой кишки при помощи описанной модели искусственного "шунта" указывают на отсутствие повреждающего влияния перфторана в отношении эндотелия микрососудов и активирующего влияния на циркулирующие в кровотоке лейкоциты и тучные клетки периваскулярного пространства брыжейки. Это указывает на отсутствие на уровне МЦР сколь-нибудь значительных повреждающих эффектов перфторуглеродной эмульсии и позволяет предполагать относительную безвредность введенного в кровеносное русло перфторана.
Вместе с тем, полученные данные не позволяют нам обоснованно выделить какой-нибудь единственный механизм, лежащий в основе противоишемического эффекта перфторана. Все это говорит о том, что данная проблема требует дальнейших углубленных исследований.
Список литературы
1. Александров П.Н., Чернух А.М. Применение метода расщепления изображения для прижизненной регистрации диаметра микрососудов. Патол. физиол. и эксперим. терапия. 1972; 1: 35-85.
2. Басараб Д.А., Кожура В.Л., Голубев А.М. и др. Исследование эффектов перфторана на модели острой интестинальной ишемии. Анест. и реаним. 2002 (6): 31-36.
3. Белоярцев Ф.Ф. Перфторированные углероды в биологии и медицине. В сб.: Перфторированные углероды в биологии и медицине. - Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1980: 5-20.
4. Воробьев С.И., Иваницкий Г.Р., Ладилов Ю.В. и др. Модификация мембран клеток перфторуглеродами как возможный механизм уменьшения степени ишемического повреждения миокарда. Докл. АН СССР. 1988; 299(1): 228-230.
5. Голубев А.М., Магомедов М.А., Леонтьева Т.А. и др. Биомикроскопическая оценка гемоциркуляторного русла брыжейки тонкой кишки при экспериментальной инфузии перфторана в условиях нормоволемии. Морфология. 1996; 109(3): 36-40.
6. Голубь А.С., Брод В.И., Кривошапкин А.Л. Реакции капиллярного русла скелетной мышцы на нормобарическую гипероксию и перфторорганический кровезаменитель. Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 1993; 79(1): 56-63.
7. Мациевский Д.Д., Белкина Л.М., Толмачева Е.А. Динамика коронарного кровотока у крыс. Бюлл. Эксперим. Биол. 1992; 114(7): 19-22.
8. Мороз В.В., Крылов Н.Л. Некогда спорные, но сегодня решенные вопросы применения перфторана в клинике. В сб.: Перфторорганические соединения в биологии и медицине - Пущино: ОНТИ НПЦ РАН. 1999: 25-32.
9. Саитгареев Р.Ш., Северин В.В., Крапивский А.Я. и др. Использование перфторуглеродной эмульсии для защиты сосудистого эндотелия при трансплантации органов / Материалы Всеармейской научной конференции "Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов".- СПб. 1997: 92-97.
10. Mathy-Hartert M., Krafft M.P., Deby C., et al. Effects of perfluorocarbon emulsions on cultured human endothelial cells. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 1997; 25(6): 563-575.
11. Mohan C., Gennaro M., Marini C., et al. Reduction of the extent of ischemic skeletal muscle necrosis by perfusion with oxygenated perfluorocarbon. Am. J. Surg. 1992; 164(3): 194-198.
12. Yabe Y., Ishiguro N., Shimizu T., et al. A perfluorochemical prevents ischemia-reperfusion injury of muscle. J. Surg. Res. 1996; 64: 89-94.
В наших предыдущих работах [2] на модели острой критической сегментарной интестинальной ишемии у крыс была показана возможность коррекции губительного каскада реперфузионных расстройств в стенке кишки перфтораном, введенным на этапе ишемии в системный кровоток. Опираясь на литературные данные о механизмах противоишемического действия перфторуглеродных эмульсий в кровеносном русле [3, 4, 8, 9, 10, 11, 12 и др.], а также на современные представления о патогенезе ишемических и реперфузионных расстройств, мы рассматривали перфторан в этом аспекте не с традиционных позиций лишь переносчика кислорода, а скорее как препарата, обладающего рядом негазотранспортных, и в первую очередь реологических, свойств. Для расширения представлений о механизмах противоишемического действия перфторана нами была поставлена цель: изучить эффекты этого препарата в микроциркуляторном русле брыжейки тонкой кишки крыс на модели полной критической интестинальной ишемии-реперфузии.
Материалы и методы
Эксперименты по изучению микроциркуляции в брыжейке были проведены на половозрелых беспородных белых крысах-самцах массой от 220 до 300г. Общую анестезию производили внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (нембутала) в дозе 5-7 мг/ 100 г массы тела. АД регистрировали посредством катетера, установленного в левой бедренной артерии. Перфторуглеродную эмульсию "Перфторан" (ОАО НПЦ "Перфторан", Пущино) или физиологический раствор хлорида натрия 0,9% вводили в правую внутреннюю яремную вену крыс в дозе 0,4-0,5 мл/100 г массы тела (6-7% ОЦК). Предварительной оксигенации (барботажа) перфторуглеродной эмульсии не проводили, в ходе эксперимента крыса дышала атмосферным воздухом через трахеостомическую трубку.
Рис. 1. Изучаемая феноменология поведения лейкоцитов в микроциркуляторном русле: роллинг, плотная адгезия, трансмиграция в венуле диаметром 50 мкм. Биомикроскопия. Ув.252х. Отметка-20 мкм.
1 - "катящийся" по стенке венулы лейкоцит
2 - лейкоцит, плотно адгезированный к стенке венулы
3 - трансэндотелиальная миграция лейкоцита в периваскулярное пространство
4 - тучная клетка без признаков дегрануляции
Наблюдение за функционированием микроциркуляторного русла (МЦР) брыжейки тонкой кишки проводили в условиях проходящего света на микроскопе МБИ-15, снабженным фоторегистрацией. Изучение феноменологии лейкоцит-эндотелиальных взаимодействий (рис.1) проводили в капиллярах и венулах до 150-200 мкм, располагающихся в лишенных жировой клетчатки "окнах" брыжейки. Измерение диаметра "питающих" артерий брыжейки проводили методом расщепления изображения в модификации П.Н. Александрова и А.М. Чернуха (1972) [1]; сигнал, пропорциональный наружному диаметру сосуда, регистрировали на самописце одновременно с кривой системного АД. Для регистрации линейной скорости кровотока в "питающих" артериях брыжейки тонкой кишки у крыс нами применен ультразвуковой допплеровский метод (электронная система и миниатюрные датчики были разработаны и сконструированы Д. Д. Мациевским [7]). Объемная скорость кровотока в "питающих" артериях брыжейки диаметром 50-400 мкм (рис.2) была оценена исходно и через 1, 5, 10, 15 и 30 минут после введения в кровоток растворов по формуле:
BF=((FV*1000) * ( рR2/4))/1000000,
где BF - объемная скорость кровотока (нл/с), FV - линейная скорость кровотока (мм/с), R - радиус наружного контура сосуда (мкм).
Статистическую обработку данных производили с использованием критерия Стьюдента.
Рис. 2. "Питающие" артерии брыжейки ("feeding" arteries) 150-250 мкм, измеряемые методом расщепления изображения. Биомикроскопия. Ув. 22х. Отметка - 200 мкм.
1 - "питающая" артерия
2 - соответствующая венула
3 - стенка кишки
Результаты исследований. В ходе экспериментов по изучению объемно-скоростных характеристик тока крови по "питающим" сосудам брыжейки эффекты введения перфторана и физиологического раствора характеризовали как величину кровотока в каждый соответствующий период в процентах от его исходного значения (табл. 1, рис. 3).
Таблица 1. Исходные значения артериального давления (АД, мм.рт.ст), диаметра "питающих" артерий брыжейки (D, мкм), линейной скорости кровотока (FV, мм/с) объемной скорости кровотока (BF, нл/с); динамика изменений объемной скорости кровотока (%BF, в % от исходных значений), (M+m, для исходной BF - min, max). Интактные животные после введения 1,0 мл перфторана или физиологического раствора.
| Гр. | АД исх | D исх | FV исх | BF исх | %BF1' | %BF5' | %BF10' | %BF15' | %BF30' |
| ПФ | 91+13 (n=5) | 215+32(n=5) | 11+3 | min 147, max 997 | 146+45(n=5) * | 94+45,5(n=5) | 65+23,5(n=5) * | 42+15(n=5) * | 40+9(n=5) ** |
| ФР | 106+5 (n=6) | 193+28(n=6) | 8+2 | min 71, max 739 | 127+21(n=5) ** | 67+13(n=5) ** | 67+18(n=5) * | 41+9(n=5) ** | 66+17(n=5) * |
n - количество животных; ПФ - перфторан; ФР - физиологический раствор
* - р<0,05, ** - p<0,01 (внутри группы относительно исходных показателей BF)
Рис. 3.
На фоне стабильных показателей АД показано, что сразу после введения перфторана и физиологического раствора к 1-й минуте происходит кратковременное увеличение кровотока в артериях, объемная скорость которого к 5-й минуте возвращается к исходному уровню и в последующем конкордантно снижается в обеих группах, составляя через 25-30 минут после введения примерно половину от исходной. При этом существенных межгрупповых отличий нами отмечено не было.
Рис. 4. Схема, иллюстрирующая принцип регионарной мезентериальной перфузии перфтораном - реперфузии собственной кровью с помощью оригинального "шунта"
1 - левая общая сонная артерия
2 - место наложения на "шунт" окклюдера
3 - магистраль "тройника" для подачи в мезентериальное русло перфторана
4 - краниальная брыжеечная артерия
5 - левая бедренная артерия (регистрация АД)
Для изучения возможного влияния перфторана на процессы, происходящие в микроциркуляторном русле брыжейки, был сконструирован специальный "шунт" позволяющий проводить регионарную перфузию мезентериального бассейна попеременно перфтораном и собственной кровью животного из левой общей сонной артерии (рис. 4). В ходе нескольких минут регионарной перфузии тонкой кишки 2,5-3,0 мл перфторана было отмечено постепенное "отмывание" от форменных элементов различных отделов МЦР. При перфузии перфтораном, а в последующем и при возобновлении кровотока по "шунту" в "окнах" брыжейки каких-либо структурно-функциональных нарушений МЦР в виде спазмированных артериол, стазов, тромбозов и кровоизлияний зарегистрировано не было. При биомикроскопии с большим увеличением не было выявлено признаков лейкоцитарной инфильтрации брыжейки и дегрануляции тучных клеток. Как правило, форма, расположение и размеры клеточных структур, а также интенсивность и характер лейкоцит-эндотелиальных взаимодействий видимых изменений не претерпевали. Степень функционирования различных отделов МЦР брыжейки тонкой кишки до, во время и после регионарной перфузии краниальной брыжеечной артерии перфтораном оставалась в целом неизменной.
Обсуждение
В клинических исследованиях неоднократно указывается на "улучшение микроциркуляции" при введении перфторана в регионарное и системное кровеносное русло. В ряде работ подчеркивается эффективный микрогемодинамический эффект небольших доз перфторана (2-8 мл/кг массы тела) при острой массивной кровопотере в результате улучшения условий гемоциркуляции, ликвидации спазма периферического русла, уменьшения отека эндотелия микрососудов, снижения вязкости цельной крови, повышения эластичности форменных элементов крови, уменьшения индекса агрегации эритроцитов [5, 6, 8]. Результаты ранее проведенных нами экспериментов [2] косвенно указывают на наличие у перфторана реологических эффектов и эндотелий-протекторных свойств, что не противоречит литературным данным [3, 8, 9, 10].
Благодаря уникальному методическому приему, в наших экспериментах оказалось возможным прижизненно определять объемную скорость кровотока в микрососудах до 50-400 мкм. Эксперименты на интактных животных с использованием ультразвукового допплеровского метода позволяют судить об отсутствии существенных межгрупповых различий в объемной скорости кровотока на фоне введения гемодинамически незначимых количеств перфторана (6,2% ОЦК) в сравнении с физиологическим раствором (табл. 1). Результаты экспериментов с регионарной перфузией перфтораном и реперфузией кровью тонкой кишки при помощи описанной модели искусственного "шунта" указывают на отсутствие повреждающего влияния перфторана в отношении эндотелия микрососудов и активирующего влияния на циркулирующие в кровотоке лейкоциты и тучные клетки периваскулярного пространства брыжейки. Это указывает на отсутствие на уровне МЦР сколь-нибудь значительных повреждающих эффектов перфторуглеродной эмульсии и позволяет предполагать относительную безвредность введенного в кровеносное русло перфторана.
Вместе с тем, полученные данные не позволяют нам обоснованно выделить какой-нибудь единственный механизм, лежащий в основе противоишемического эффекта перфторана. Все это говорит о том, что данная проблема требует дальнейших углубленных исследований.
Список литературы
1. Александров П.Н., Чернух А.М. Применение метода расщепления изображения для прижизненной регистрации диаметра микрососудов. Патол. физиол. и эксперим. терапия. 1972; 1: 35-85.
2. Басараб Д.А., Кожура В.Л., Голубев А.М. и др. Исследование эффектов перфторана на модели острой интестинальной ишемии. Анест. и реаним. 2002 (6): 31-36.
3. Белоярцев Ф.Ф. Перфторированные углероды в биологии и медицине. В сб.: Перфторированные углероды в биологии и медицине. - Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1980: 5-20.
4. Воробьев С.И., Иваницкий Г.Р., Ладилов Ю.В. и др. Модификация мембран клеток перфторуглеродами как возможный механизм уменьшения степени ишемического повреждения миокарда. Докл. АН СССР. 1988; 299(1): 228-230.
5. Голубев А.М., Магомедов М.А., Леонтьева Т.А. и др. Биомикроскопическая оценка гемоциркуляторного русла брыжейки тонкой кишки при экспериментальной инфузии перфторана в условиях нормоволемии. Морфология. 1996; 109(3): 36-40.
6. Голубь А.С., Брод В.И., Кривошапкин А.Л. Реакции капиллярного русла скелетной мышцы на нормобарическую гипероксию и перфторорганический кровезаменитель. Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 1993; 79(1): 56-63.
7. Мациевский Д.Д., Белкина Л.М., Толмачева Е.А. Динамика коронарного кровотока у крыс. Бюлл. Эксперим. Биол. 1992; 114(7): 19-22.
8. Мороз В.В., Крылов Н.Л. Некогда спорные, но сегодня решенные вопросы применения перфторана в клинике. В сб.: Перфторорганические соединения в биологии и медицине - Пущино: ОНТИ НПЦ РАН. 1999: 25-32.
9. Саитгареев Р.Ш., Северин В.В., Крапивский А.Я. и др. Использование перфторуглеродной эмульсии для защиты сосудистого эндотелия при трансплантации органов / Материалы Всеармейской научной конференции "Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов".- СПб. 1997: 92-97.
10. Mathy-Hartert M., Krafft M.P., Deby C., et al. Effects of perfluorocarbon emulsions on cultured human endothelial cells. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 1997; 25(6): 563-575.
11. Mohan C., Gennaro M., Marini C., et al. Reduction of the extent of ischemic skeletal muscle necrosis by perfusion with oxygenated perfluorocarbon. Am. J. Surg. 1992; 164(3): 194-198.
12. Yabe Y., Ishiguro N., Shimizu T., et al. A perfluorochemical prevents ischemia-reperfusion injury of muscle. J. Surg. Res. 1996; 64: 89-94.