Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Создание перфторана и других кровезаменителей на основе перфторорганических соединений (ПФОС) с газотранспортной функцией, несомненно, является революционным событием в медицине и биологии. Исследования, проведенные с перфтораном, и практические результаты, достигнутые при изучении ПФОС, подняли новые пласты научных данных свидетельствующих о перспективности их использования в биологии и медицине [1-3].
К сожалению, в последние годы область изучения ПФОС сузилась и в большей мере стала сугубо медицинской [4]. Об этом свидетельствует тот факт, что 99% всех научных публикаций в этой области имеет исключительно клиническую направленность. Такое сужение направленности исследований перфторуглеродов лишь областью медицины и созданием кровезаменителей существенно обедняет результативность и возможности их использования для практических нужд. Вне внимания ученых осталась такая обширная область приложения перфторуглеродов, как биотехнология. Как показали результаты исследований, проведенных сотрудниками Вятского государственного университета, биотехнологам и главному объекту биотехнологии - микроорганизмам тоже нужна <голубая кровь> [5-7]. Чтобы показать значение этого вывода необходимо сделать небольшой экскурс в биотехнологию.
Соотношение публикаций по проблеме использования перфторуглеродов в медицине и биологии
Термин <биотехнология> был предложен в 1917г. венгерским инженером Карлом Эреки. По определению Эреки, биотехнология - это <все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты> [8]. Как это не парадоксально звучит, но впервые он применил этот термин для описания процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. Современный смысл термин <биотехнология> получил с 1961 г. когда шведский микробиолог Карл Герен Хеден порекомендовал изменить название научного журнала (<Журнал микробиологической и химической инженерии и технологии>), специализирующегося на публикациях по прикладной микробиологии и промышленной ферментации на (<Биотехнология и биоинженерия>). С этого времени биотехнология четко и необратимо связана с исследованиями в области <промышленного производства товаров и услуг при участии живых организмов, биологических систем и процессов> и встала на прочный фундамент микробиологии, биохимии, генетики и химической инженерии.
В последние годы биотехнология приобретает все большее значение в хозяйственной деятельности экономически развитых государств. Она базируется, прежде всего, на использовании микроорганизмов, биосинтетические возможности и метаболизм которых обеспечивают эффективное получение самых разнообразных жизненно важных для нужд человека материалов: альтернативных источников энергии, медицинских препаратов, продуктов питания, химических веществ. Биотехнологи разрабатывают технологии применения микроорганизмов в различных областях промышленности и сельского хозяйства, создают системы микробиологической деградации ксенобиотиков и отходов производств. Начиная с середины ХХ века, в качестве лучшей модели для исследований в области молекулярной биологии была признана кишечная палочка (Escherichia coli). Позже внимание генных инженеров привлекли внимание и другие микроорганизмы: обычные пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), бактерии родов Pseudomonas, Streptomyces, Agrobacterium, Bacillus и др., занимающие в настоящее время в биоиндустрии ведущие места.
С начала 80-х годов ХХ века среди биотехнологических фирм началась конкуренция за создание новых технологий большеобъемного культивирования микроорганизмов и получения рекомбинантных микробных штаммов продуцентов самых разнообразных дефицитных биологически активных соединений, получение которых традиционными методами весьма трудоемко и экономически убыточно.
Такие задачи как: получение трансгенных или рекомбинантных микроорганизмов, способных продуцировать антибиотики, витамины, аминокислоты, гормоны, иммуномодуляторы, биополимеры, биопестициды, различные химические соединения, продукты питания или обеспечивающих создание эффективных поливалентных вакцин, пробиотиков, сверхчувствительных диагностических тест-систем, биосенсоров, систем биодеградации разнообразных ксенобиотиков и отходов производств, извлечение химических элементов из истощенных источников и океанических вод, а также разработка технологий глубинного культивирования таких микробов, способны решить многие проблемы, которые стоят перед человечеством в третьем тысячелетии.
По обоснованным оценкам, взятым из разных источников, биотехнологические производства, связанные с использованием микроорганизмов, создают в настоящее время продукции на сумму около четырехсот млрд. долларов в год и ежегодно эта цифра увеличивается на 12-14% [6, 8].
Главный признак микроорганизмов, получивший отражение в обобщенном названии самой многочисленной группы организмов - это малая величина особи. С ним существенно связаны также особенности морфологии микробов, активность и пластичность их метаболизма, удобство обращения с ними в лаборатории, а также уникальная способность воспринимать и экспрессировать чужеродные гены, ответственные за продукцию практически полезных веществ. Большинство микроорганизмов, используемых в биотехнологии, крайне неприхотливо к источникам питания, условиям роста и обладает исключительно высокой скоростью деления. Время генерации кишечной палочки при 37?С составляет около 20 минут. Это значит, что одна микробная клетка способна дать за сутки потомство численностью до 272.
Размер большинства микроорганизмов используемых в биотехнологии не превышает 1-5 микрометров. Величина - 1 микрометр (микрон) стала <аршином> микробиологов. У столь малых организмов соотношение между поверхностью и объемом очень велико. Правило Рубнера гласит, что энергетический обмен организма пропорционален не массе, а поверхности его тела. Если это правило распространить на отдельные микробные клетки, то уровни метаболической активности их будут на много порядков выше, чем у макроорганизмов [9].
Поэтому для обеспечения столь высокого энергетического обмена большинству микроорганизмов, используемых человеком в биотехнологии, для роста, развития и продукции биологически активных веществ жизненно необходим кислород.
Он непосредственно участвует в различных биохимических реакциях, обеспечивающих процессы жизнедеятельности микробов. Кислород является важнейшим элементом, используемым микроорганизмами для построения структурных компонентов микробной клетки и получения энергии, его доля в сухом веществе клетки составляет 30-35%, в активных вегетативных клетках его содержание за счет кислорода воды его всегда больше 60% [9].
Кислород поступает в клетки в составе воды, диоксида углерода и органических соединений. Однако подавляющему большинству используемых в биотехнологии микроорганизмов крайне необходим молекулярный кислород. Главная функция О2 состоит в том, что он служит конечным акцептором электронов при аэробном дыхании. Кислород является наиболее реакционноспособным компонентом воздуха. В структурные компоненты клетки атомы кислорода, включаются в том случае, если источниками углерода служат метан, углеводороды с длинной цепью или ароматические углеводороды.
Сухой воздух у поверхности Земли содержит по объему 78,09% азота, 20,95% кислорода, 0,03% диоксида углерода, 0,93% аргона (по массе - 75,51% азота, 23,15% кислорода, 1,28% аргона, 0,046% диоксида углерода) [10]. Однако микроорганизмы способны ассимилировать только кислород растворенный в воде, питательных средах и других субстратах.
Изучение потребности микроорганизмов в кислороде началось с открытия Луи Пастером факта его использования дрожжами для окисления источников углерода и энергии. Количественное исследование этого явления начало практически решаться в первой половине ХХ века с внедрением инструментальных методов контроля интенсивности дыхания и стехиометрии окисления субстрата. С середины прошлого столетия с развитием глубинного культивирования разнообразных микробов проблема обеспечения глубинных культур О2 стала одной из основных при разработке управляемого промышленного выращивания микроорганизмов [11]. При выращивании микроорганизмов в ферментерах или аппаратах большого объема в промышленных условиях обеспечение кислородом или его удаление для анаэробов, как и удаление отработанных газов и продуктов метаболизма является одним из важнейших факторов, определяющих продуктивность процесса накопления их биомассы и синтеза биологически активных веществ.
Для микроорганизмов, растущих на поверхности плотной питательной среды или в тонких слоях жидкости в присутствии воздуха, кислорода обычно достаточно. В жидких средах при большом объеме жидкости аэробные микроорганизмы могут расти только на поверхности, так как в более глубоких слоях по мере удаления от поверхности условия приближаются к анаэробным. Для нормального роста аэробных микроорганизмов в глубоких слоях жидкой культуры требуется аэрация. В то время как минеральные соли и органические вещества можно добавлять в среду в концентрациях, обеспечивающих рост микробов на протяжении нескольких часов и даже дней, с молекулярным кислородом этого сделать нельзя из-за малой растворимости в воде.
Литр воды при 20?С и нормальном атмосферном давлении содержит всего лишь 6,2 мл или 0,28 ммолей кислорода. Такого количества достаточно для окисления не более 0,046 ммолей или 8,3 мг глюкозы (т. е. примерно одной тысячной общего количества глюкозы, содержащейся в обычных питательных средах) [10]. Присутствующие в питательных средах растворенные вещества (сахара, минеральные соли и др.), как правило, еще больше уменьшают растворимость кислорода. Поэтому в среде невозможно создать значительный запас О2 и кислород приходится добавлять в жидкую среду непрерывно.
Для аэрации жидких культур пользуются либо обычным воздухом, либо смесью кислорода, азота и диоксида углерода. Потребление кислорода микроорганизмами зависит от индивидуальных особенностей культуры, состава среды, физиологической активности клеток, фазы развития популяции, концентрации кислорода в среде. Скорость перехода молекулярного кислорода в раствор возрастает с повышением парциального давления О2 и с увеличением поверхности раздела между газовой и жидкой фазами. Необходимость своевременного и качественного обеспечения микробных клеток кислородом при глубинном культивировании заставляет биотехнологов прибегать к разнообразным дорогостоящим ухищрениям, которые, однако, не обеспечивают во многих случаях равномерное и полноценное снабжение всей популяции микробов О2 и удаление отработанных газообразных продуктов из среды.
Растворимость кислорода в культуральной среде при выращивании микроорганизмов незначительна и составляет всего несколько граммов О2 на м3. Потребность же аэробных микроорганизмов в кислороде может составлять десятки килограммов О2 на кубический метр культуральной среды в час.
Между удельной скоростью роста микроорганизмов и концентрацией растворенного в культуральной среде кислорода существует зависимость, которую можно выразить уравнением Михаэлиса-Ментен [11]:
m = mmc*C/(Kmc+C) ,
где m - удельная скорость роста микроорганизмов при концентрации растворенного в культуральной среде кислорода (С), - ч-1;
mmc - предел к которому стремится m при увеличении концентрации растворенного в культуральной среде кислорода, ч-1;
Kmc - константа, численно равна той концентрации растворенного в культуральной среде кислорода, при которой m =0,5mmc, кг О2 м-3;
С - текущая (рабочая) концентрация кислорода, растворенного в культуральной среде, кг О2 м-3.
Значение константы Kmc в уравнении (1) для подавляющего большинства микроорганизмов очень мало. Например, для культур дрожжей при выращивании в средах с углеводами Kmc > 5*10-5 кг О2 м-3. Значение равновесной концентрации растворенного в такой культуральной среде кислорода при температуре 30?С с кислородом воздуха при атмосферном давлении (Ср) равно 6,8.10-3 кг О2 м-3.
Концентрацию растворенного в среде кислорода, меньше которой быстро снижается удельная скорость роста микроорганизмов, принято называть критической (Скр). Значение критической концентрации находят опытным путем и это значение не является строго определенной величиной, с определенным допущением можно принять, что критическая концентрация приблизительно равна одной десятой от равновесной концентрации (Скр > 0,1Ср). Следует отметить, что на некоторые микроорганизмы кислород, растворенный в среде выше определенных значений, может оказывать ингибирующее действие. Поэтому при изучении физиологии каждого микроорганизма необходимо определить ингибирующую концентрацию (Синг), выше которой их рост подавляется.
Интенсивный рост микроорганизмов при глубинном культивировании приводит к тому, что кислород, растворенный в культуральной среде, микроорганизмы поглощают в течение первых минут роста, а существующие технологии аэрации не в полной мере обеспечивают снабжение кислородом и газообмен глубинных культур микробов.
Практические микробиологи и биотехнологи, работающие на биологическом факультете Вятского Государственного университета, подошли к решению проблемы улучшения транспорта газов у глубинных культур микроорганизмов, с нетривиальной позиции - с использования общих закономерностей процессов обеспечения клеток и тканей организма человека с помощью крови для решения вопросов обеспечения кислородом культивируемых микробов с помощью аналогов крови с газотранспортной функцией на основе перфторорганических соединений.
Результаты исследований показали, что при культивировании эукариотических и прокариотических микроорганизмов, являющихся источником различных биологических продуктов, и обладающих более высоким обменом, чем организмы человека и животных, следовательно, и повышенной потребностью в кислороде, углекислом газе или анаэробных процессах, весьма эффективно применение перфторуглеродов. По-видимому, ПФОС не только обеспечивает увеличение концентрации кислорода в среде, но и улучшает доставку его клеткам, модифицирует клеточные мембраны, стимулируя транспорт питательных веществ и газовый обмен у микроорганизмов в глубинных культурах.
Нами было проведено культивирование микроорганизмов прокариотов, относящихся к энтеробактериям, псевдомонадам, бациллам, актиномицетам, цианобактериям, ярровиям, родококкам, и эукариотов, относящихся к простейшим и микромицетам. При этом было показано, что добавление в среду ПФОС с газотранспортной функцией во многих случаях значительно ускоряет рост и развитие микроорганизмов, продукцию ими биологически активных веществ, а также разрушение микроорганизмами ксенобиотиков.
Результаты исследований, часть из которых будет изложена в представляемых на данную конференцию докладах, показали, что с помощью перфторуглеродов, обладающих газотранспортной функцией, возможно решение общих и частных вопросов микробиологического синтеза биологически активных веществ, создания новых систем микробиологической деградации экотоксикантов, производства разнообразных препаратов.
Не надо быть большим пророком, чтобы предсказать, что именно в области биотехнологии, основанной на культивировании культур микроорганизмов, в ближайшее десятилетие произойдет прорыв в применении перфторуглеродов. Относительная дороговизна ПФОС сторицей окупится результатами их применения в разных областях биотехнологии.
Спрос для биотехнологии на ПФОС ввиду их уникальных газотранспортных свойств, в ближайшие годы должен возрасти в десятки и сотни раз. Тем более удивительно, что на состоявшемся в октябре 2002 г. в Москве 1-ом Международном конгрессе <Биотехнология: состояние и перспективы развития> не было докладов, посвященных вопросу применения перфторуглеродов в биотехнологии [12]. Хочется верить, что на следующем конгрессе, который должен состояться 14-17 октября 2003 г., таких докладов должно быть не меньше десятка.
Список литературы
1. Иваницкий Г. Р. Биофизические основы создания перфторуглеродных сред и газотранспортных кровезаменителей (обзор) //Сборник научных трудов НПФ <Перфторан>: Перфторорганические соединения в биологии и медицине. - Пущино: ПНЦ РАН, 2001. Вып. XI. - С. 4-48.
2. Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине / Под ред. Г. А. Сафронова Тез. науч. конф. 19-20 июня 2001 г. Санкт-Петербург: ВМА, 2001. - С. 129
3. Краснова В. Российская компания решила создать косметический брэнд мирового класса. Для этого ей понадобились инновационный продукт и техника сетевого маркетинга // Эксперт, 2002. ? 20. - С. 26-34.
4. Перфторорганические соединения в медицине и биологии //Сборник материалов XII Международной конференции (Пущино, 25-26 июня 2002 г.). - ГП <Серпуховская типография>, 2002. - С. 206
5. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Кривошеина Н. А. и др. Оптимизация биотехнологического процесса выращивания -актиномицетов с использованием перфторуглеродов//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. <Наука-производство-технологии-экология>, Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.?3. С. 90-91.
6. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Золотарев А. Г., Кривошеина Н. А. Нужна ли <голубая кровь микроорганизмам>?// МВФ. Медицина. Фармация, 2003, ? 2. - С. 7-11.
7. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Кривошеина Н. А. и др. Влияние перфторана и перфтордекалина в питательных средах на биосинтез у микромицетов//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. <Наука-производство-технологии-экология>, Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.?3. С. 88-89.
8. Глик Б. Р., Пасернак Д. Д. Молекулярная биотехнология. - М.: Мир, 2002. - С. 592
9. Шлегель Г. Г. Общая микробиология. - М.: Мир, 1987. - С. 568
10. Химия: Справ. изд. / В. Шретер, К. Лаутеншлегер, Х. Бибрак и др.: Пер. с нем. 2-е изд., стереотип. - М.: Химия, 2000. - С. 648
11. Промышленная микробиология / Под ред. Н. С. Егорова. - М.: Высшая школа, 1989. - С. 688
12. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Материалы 1-го Международного Конгресса. Москва, 14-18 октября 2002 г. - М.:ЗАО Максима>, РХТУ им Д. И. Менделеева, 2002. - С. 544
К сожалению, в последние годы область изучения ПФОС сузилась и в большей мере стала сугубо медицинской [4]. Об этом свидетельствует тот факт, что 99% всех научных публикаций в этой области имеет исключительно клиническую направленность. Такое сужение направленности исследований перфторуглеродов лишь областью медицины и созданием кровезаменителей существенно обедняет результативность и возможности их использования для практических нужд. Вне внимания ученых осталась такая обширная область приложения перфторуглеродов, как биотехнология. Как показали результаты исследований, проведенных сотрудниками Вятского государственного университета, биотехнологам и главному объекту биотехнологии - микроорганизмам тоже нужна <голубая кровь> [5-7]. Чтобы показать значение этого вывода необходимо сделать небольшой экскурс в биотехнологию.
Термин <биотехнология> был предложен в 1917г. венгерским инженером Карлом Эреки. По определению Эреки, биотехнология - это <все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты> [8]. Как это не парадоксально звучит, но впервые он применил этот термин для описания процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. Современный смысл термин <биотехнология> получил с 1961 г. когда шведский микробиолог Карл Герен Хеден порекомендовал изменить название научного журнала
В последние годы биотехнология приобретает все большее значение в хозяйственной деятельности экономически развитых государств. Она базируется, прежде всего, на использовании микроорганизмов, биосинтетические возможности и метаболизм которых обеспечивают эффективное получение самых разнообразных жизненно важных для нужд человека материалов: альтернативных источников энергии, медицинских препаратов, продуктов питания, химических веществ. Биотехнологи разрабатывают технологии применения микроорганизмов в различных областях промышленности и сельского хозяйства, создают системы микробиологической деградации ксенобиотиков и отходов производств. Начиная с середины ХХ века, в качестве лучшей модели для исследований в области молекулярной биологии была признана кишечная палочка (Escherichia coli). Позже внимание генных инженеров привлекли внимание и другие микроорганизмы: обычные пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), бактерии родов Pseudomonas, Streptomyces, Agrobacterium, Bacillus и др., занимающие в настоящее время в биоиндустрии ведущие места.
С начала 80-х годов ХХ века среди биотехнологических фирм началась конкуренция за создание новых технологий большеобъемного культивирования микроорганизмов и получения рекомбинантных микробных штаммов продуцентов самых разнообразных дефицитных биологически активных соединений, получение которых традиционными методами весьма трудоемко и экономически убыточно.
Такие задачи как: получение трансгенных или рекомбинантных микроорганизмов, способных продуцировать антибиотики, витамины, аминокислоты, гормоны, иммуномодуляторы, биополимеры, биопестициды, различные химические соединения, продукты питания или обеспечивающих создание эффективных поливалентных вакцин, пробиотиков, сверхчувствительных диагностических тест-систем, биосенсоров, систем биодеградации разнообразных ксенобиотиков и отходов производств, извлечение химических элементов из истощенных источников и океанических вод, а также разработка технологий глубинного культивирования таких микробов, способны решить многие проблемы, которые стоят перед человечеством в третьем тысячелетии.
По обоснованным оценкам, взятым из разных источников, биотехнологические производства, связанные с использованием микроорганизмов, создают в настоящее время продукции на сумму около четырехсот млрд. долларов в год и ежегодно эта цифра увеличивается на 12-14% [6, 8].
Главный признак микроорганизмов, получивший отражение в обобщенном названии самой многочисленной группы организмов - это малая величина особи. С ним существенно связаны также особенности морфологии микробов, активность и пластичность их метаболизма, удобство обращения с ними в лаборатории, а также уникальная способность воспринимать и экспрессировать чужеродные гены, ответственные за продукцию практически полезных веществ. Большинство микроорганизмов, используемых в биотехнологии, крайне неприхотливо к источникам питания, условиям роста и обладает исключительно высокой скоростью деления. Время генерации кишечной палочки при 37?С составляет около 20 минут. Это значит, что одна микробная клетка способна дать за сутки потомство численностью до 272.
Размер большинства микроорганизмов используемых в биотехнологии не превышает 1-5 микрометров. Величина - 1 микрометр (микрон) стала <аршином> микробиологов. У столь малых организмов соотношение между поверхностью и объемом очень велико. Правило Рубнера гласит, что энергетический обмен организма пропорционален не массе, а поверхности его тела. Если это правило распространить на отдельные микробные клетки, то уровни метаболической активности их будут на много порядков выше, чем у макроорганизмов [9].
Поэтому для обеспечения столь высокого энергетического обмена большинству микроорганизмов, используемых человеком в биотехнологии, для роста, развития и продукции биологически активных веществ жизненно необходим кислород.
Он непосредственно участвует в различных биохимических реакциях, обеспечивающих процессы жизнедеятельности микробов. Кислород является важнейшим элементом, используемым микроорганизмами для построения структурных компонентов микробной клетки и получения энергии, его доля в сухом веществе клетки составляет 30-35%, в активных вегетативных клетках его содержание за счет кислорода воды его всегда больше 60% [9].
Кислород поступает в клетки в составе воды, диоксида углерода и органических соединений. Однако подавляющему большинству используемых в биотехнологии микроорганизмов крайне необходим молекулярный кислород. Главная функция О2 состоит в том, что он служит конечным акцептором электронов при аэробном дыхании. Кислород является наиболее реакционноспособным компонентом воздуха. В структурные компоненты клетки атомы кислорода, включаются в том случае, если источниками углерода служат метан, углеводороды с длинной цепью или ароматические углеводороды.
Сухой воздух у поверхности Земли содержит по объему 78,09% азота, 20,95% кислорода, 0,03% диоксида углерода, 0,93% аргона (по массе - 75,51% азота, 23,15% кислорода, 1,28% аргона, 0,046% диоксида углерода) [10]. Однако микроорганизмы способны ассимилировать только кислород растворенный в воде, питательных средах и других субстратах.
Изучение потребности микроорганизмов в кислороде началось с открытия Луи Пастером факта его использования дрожжами для окисления источников углерода и энергии. Количественное исследование этого явления начало практически решаться в первой половине ХХ века с внедрением инструментальных методов контроля интенсивности дыхания и стехиометрии окисления субстрата. С середины прошлого столетия с развитием глубинного культивирования разнообразных микробов проблема обеспечения глубинных культур О2 стала одной из основных при разработке управляемого промышленного выращивания микроорганизмов [11]. При выращивании микроорганизмов в ферментерах или аппаратах большого объема в промышленных условиях обеспечение кислородом или его удаление для анаэробов, как и удаление отработанных газов и продуктов метаболизма является одним из важнейших факторов, определяющих продуктивность процесса накопления их биомассы и синтеза биологически активных веществ.
Для микроорганизмов, растущих на поверхности плотной питательной среды или в тонких слоях жидкости в присутствии воздуха, кислорода обычно достаточно. В жидких средах при большом объеме жидкости аэробные микроорганизмы могут расти только на поверхности, так как в более глубоких слоях по мере удаления от поверхности условия приближаются к анаэробным. Для нормального роста аэробных микроорганизмов в глубоких слоях жидкой культуры требуется аэрация. В то время как минеральные соли и органические вещества можно добавлять в среду в концентрациях, обеспечивающих рост микробов на протяжении нескольких часов и даже дней, с молекулярным кислородом этого сделать нельзя из-за малой растворимости в воде.
Литр воды при 20?С и нормальном атмосферном давлении содержит всего лишь 6,2 мл или 0,28 ммолей кислорода. Такого количества достаточно для окисления не более 0,046 ммолей или 8,3 мг глюкозы (т. е. примерно одной тысячной общего количества глюкозы, содержащейся в обычных питательных средах) [10]. Присутствующие в питательных средах растворенные вещества (сахара, минеральные соли и др.), как правило, еще больше уменьшают растворимость кислорода. Поэтому в среде невозможно создать значительный запас О2 и кислород приходится добавлять в жидкую среду непрерывно.
Для аэрации жидких культур пользуются либо обычным воздухом, либо смесью кислорода, азота и диоксида углерода. Потребление кислорода микроорганизмами зависит от индивидуальных особенностей культуры, состава среды, физиологической активности клеток, фазы развития популяции, концентрации кислорода в среде. Скорость перехода молекулярного кислорода в раствор возрастает с повышением парциального давления О2 и с увеличением поверхности раздела между газовой и жидкой фазами. Необходимость своевременного и качественного обеспечения микробных клеток кислородом при глубинном культивировании заставляет биотехнологов прибегать к разнообразным дорогостоящим ухищрениям, которые, однако, не обеспечивают во многих случаях равномерное и полноценное снабжение всей популяции микробов О2 и удаление отработанных газообразных продуктов из среды.
Растворимость кислорода в культуральной среде при выращивании микроорганизмов незначительна и составляет всего несколько граммов О2 на м3. Потребность же аэробных микроорганизмов в кислороде может составлять десятки килограммов О2 на кубический метр культуральной среды в час.
Между удельной скоростью роста микроорганизмов и концентрацией растворенного в культуральной среде кислорода существует зависимость, которую можно выразить уравнением Михаэлиса-Ментен [11]:
m = mmc*C/(Kmc+C) ,
где m - удельная скорость роста микроорганизмов при концентрации растворенного в культуральной среде кислорода (С), - ч-1;
mmc - предел к которому стремится m при увеличении концентрации растворенного в культуральной среде кислорода, ч-1;
Kmc - константа, численно равна той концентрации растворенного в культуральной среде кислорода, при которой m =0,5mmc, кг О2 м-3;
С - текущая (рабочая) концентрация кислорода, растворенного в культуральной среде, кг О2 м-3.
Значение константы Kmc в уравнении (1) для подавляющего большинства микроорганизмов очень мало. Например, для культур дрожжей при выращивании в средах с углеводами Kmc > 5*10-5 кг О2 м-3. Значение равновесной концентрации растворенного в такой культуральной среде кислорода при температуре 30?С с кислородом воздуха при атмосферном давлении (Ср) равно 6,8.10-3 кг О2 м-3.
Концентрацию растворенного в среде кислорода, меньше которой быстро снижается удельная скорость роста микроорганизмов, принято называть критической (Скр). Значение критической концентрации находят опытным путем и это значение не является строго определенной величиной, с определенным допущением можно принять, что критическая концентрация приблизительно равна одной десятой от равновесной концентрации (Скр > 0,1Ср). Следует отметить, что на некоторые микроорганизмы кислород, растворенный в среде выше определенных значений, может оказывать ингибирующее действие. Поэтому при изучении физиологии каждого микроорганизма необходимо определить ингибирующую концентрацию (Синг), выше которой их рост подавляется.
Интенсивный рост микроорганизмов при глубинном культивировании приводит к тому, что кислород, растворенный в культуральной среде, микроорганизмы поглощают в течение первых минут роста, а существующие технологии аэрации не в полной мере обеспечивают снабжение кислородом и газообмен глубинных культур микробов.
Практические микробиологи и биотехнологи, работающие на биологическом факультете Вятского Государственного университета, подошли к решению проблемы улучшения транспорта газов у глубинных культур микроорганизмов, с нетривиальной позиции - с использования общих закономерностей процессов обеспечения клеток и тканей организма человека с помощью крови для решения вопросов обеспечения кислородом культивируемых микробов с помощью аналогов крови с газотранспортной функцией на основе перфторорганических соединений.
Результаты исследований показали, что при культивировании эукариотических и прокариотических микроорганизмов, являющихся источником различных биологических продуктов, и обладающих более высоким обменом, чем организмы человека и животных, следовательно, и повышенной потребностью в кислороде, углекислом газе или анаэробных процессах, весьма эффективно применение перфторуглеродов. По-видимому, ПФОС не только обеспечивает увеличение концентрации кислорода в среде, но и улучшает доставку его клеткам, модифицирует клеточные мембраны, стимулируя транспорт питательных веществ и газовый обмен у микроорганизмов в глубинных культурах.
Нами было проведено культивирование микроорганизмов прокариотов, относящихся к энтеробактериям, псевдомонадам, бациллам, актиномицетам, цианобактериям, ярровиям, родококкам, и эукариотов, относящихся к простейшим и микромицетам. При этом было показано, что добавление в среду ПФОС с газотранспортной функцией во многих случаях значительно ускоряет рост и развитие микроорганизмов, продукцию ими биологически активных веществ, а также разрушение микроорганизмами ксенобиотиков.
Результаты исследований, часть из которых будет изложена в представляемых на данную конференцию докладах, показали, что с помощью перфторуглеродов, обладающих газотранспортной функцией, возможно решение общих и частных вопросов микробиологического синтеза биологически активных веществ, создания новых систем микробиологической деградации экотоксикантов, производства разнообразных препаратов.
Не надо быть большим пророком, чтобы предсказать, что именно в области биотехнологии, основанной на культивировании культур микроорганизмов, в ближайшее десятилетие произойдет прорыв в применении перфторуглеродов. Относительная дороговизна ПФОС сторицей окупится результатами их применения в разных областях биотехнологии.
Спрос для биотехнологии на ПФОС ввиду их уникальных газотранспортных свойств, в ближайшие годы должен возрасти в десятки и сотни раз. Тем более удивительно, что на состоявшемся в октябре 2002 г. в Москве 1-ом Международном конгрессе <Биотехнология: состояние и перспективы развития> не было докладов, посвященных вопросу применения перфторуглеродов в биотехнологии [12]. Хочется верить, что на следующем конгрессе, который должен состояться 14-17 октября 2003 г., таких докладов должно быть не меньше десятка.
Список литературы
1. Иваницкий Г. Р. Биофизические основы создания перфторуглеродных сред и газотранспортных кровезаменителей (обзор) //Сборник научных трудов НПФ <Перфторан>: Перфторорганические соединения в биологии и медицине. - Пущино: ПНЦ РАН, 2001. Вып. XI. - С. 4-48.
2. Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине / Под ред. Г. А. Сафронова Тез. науч. конф. 19-20 июня 2001 г. Санкт-Петербург: ВМА, 2001. - С. 129
3. Краснова В. Российская компания решила создать косметический брэнд мирового класса. Для этого ей понадобились инновационный продукт и техника сетевого маркетинга // Эксперт, 2002. ? 20. - С. 26-34.
4. Перфторорганические соединения в медицине и биологии //Сборник материалов XII Международной конференции (Пущино, 25-26 июня 2002 г.). - ГП <Серпуховская типография>, 2002. - С. 206
5. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Кривошеина Н. А. и др. Оптимизация биотехнологического процесса выращивания -актиномицетов с использованием перфторуглеродов//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. <Наука-производство-технологии-экология>, Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.?3. С. 90-91.
6. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Золотарев А. Г., Кривошеина Н. А. Нужна ли <голубая кровь микроорганизмам>?// МВФ. Медицина. Фармация, 2003, ? 2. - С. 7-11.
7. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Кривошеина Н. А. и др. Влияние перфторана и перфтордекалина в питательных средах на биосинтез у микромицетов//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. <Наука-производство-технологии-экология>, Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.?3. С. 88-89.
8. Глик Б. Р., Пасернак Д. Д. Молекулярная биотехнология. - М.: Мир, 2002. - С. 592
9. Шлегель Г. Г. Общая микробиология. - М.: Мир, 1987. - С. 568
10. Химия: Справ. изд. / В. Шретер, К. Лаутеншлегер, Х. Бибрак и др.: Пер. с нем. 2-е изд., стереотип. - М.: Химия, 2000. - С. 648
11. Промышленная микробиология / Под ред. Н. С. Егорова. - М.: Высшая школа, 1989. - С. 688
12. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Материалы 1-го Международного Конгресса. Москва, 14-18 октября 2002 г. - М.:ЗАО Максима>, РХТУ им Д. И. Менделеева, 2002. - С. 544