Медико-биологический
информационный портал
для специалистов
 
БИОМЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ Medline.ru

СОДЕРЖАНИЕ ЖУРНАЛА:
Физико-химическая биология

Клиническая медицина

Профилактическая медицина

Медико-биологические науки


АРХИВ:

Фундаментальные исследования

Организация здравохраниения

История медицины и биологии



Последние публикации

Поиск публикаций

Articles

Архив :  2000 г.  2001 г.  2002 г. 
               2003 г.  2004 г.  2005 г. 
               2006 г.  2007 г.  2008 г. 
               2009 г.  2010 г.  2011 г. 
               2012 г.  2013 г.  2014 г. 
               2015 г.  2016 г.  2017 г. 

Редакционная информация:
        Опубликовать статью
        Наша статистика


 РЕДАКЦИЯ:
Главный редактор

Заместители главного редактора

Члены редколлегии
Специализированные редколлегии


 УЧРЕДИТЕЛИ:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
"Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства"
(ФГБУН ИТ ФМБА России)

Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

ООО "ИЦ КОМКОН".




Адрес редакции и реквизиты

199406, Санкт-Петербург, ул.Гаванская, д. 49, корп.2

ISSN 1999-6314

Российская поисковая система
Искать: 


ТОМ 4, СТ. 64 (сc. 86-87) // Февраль, 2003 г.

МЕТОДИКА ОРИЕНТИРОВОЧНОГО УСТАНОВЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ СПЕРМЫ В ПЯТНАХ НА ВЕЩЕСТВЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВАХ С ПОМОЩЬЮ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИЗМЕРЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЦИНКА

В.Л. Сидоров, Р.В. Бабаханян, Г.И. Заславский, М.В. Маяцкая, В.Л. Попов
Ленинградская область



  << Содержание

 

Для ориентировочного определения наличия спермы в отечественной судебно-медицинской практике было предложено несколько различных методик, но до настоящего времени основным является фитоагглютинационный метод, который основан на реакции с соком из клубней картофеля. Кроме того, в судебно-медицинской практике достаточно долгое время применялась реакция на кислую фосфотазу.

За рубежом был предложен ориентировочный метод установления наличия спермы как в мазках и тампонах с содержимым влагалища, так и в пятнах на вещественных доказательствах. При этом вышеуказанные исследователи отмечают, что метод, основанный на количественном определении цинка, более чувствительный, чем реакция на кислую фосфотазу, так как органические вещества разрушаются значительно быстрее под действием условий окружающей среды, чем неорганические.

Целью нашей работы была оценка возможности применения метода количественного содержания цинка в водных экстрактах для ориентировочного обнаружения спермы на вещественных доказательствах. В данной работе описаны результаты применения методики выполнения измерений массовых концентраций цинка в пробах природной, питьевой и сточной воды на анализаторе "ФЛЮОРАТ-02-3М", разработанной МНПФ "Люмэкс", и адаптированном к решению судебно-медицинских задач.

Материалы и методы. При выполнении измерений массовой концентрации цинка применяют следующие средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства, материалы и растворы.

1. Средства измерения: анализатор жидкости "Флюорат-02-ЗМ" ТУ 4321-001-20506233-94, весы лабораторные общего назначения ГОСТ 24104 - 88Е 2-го класса точности (ВЛР-200, ВЛА-200), меры массы ГОСТ 7328 - 82, колбы мерные 2-1000-2, 2-100-2, 2-50-2, ГОСТ 1770 - 74Е 2-25-2, пипетки с одной отметкой 2-2-5, 2-2-10, ГОСТ 29169-91 2-2-25 либо соответствующие самплеры, пипетки градуированные 2-го класса ГОСТ 29227-91 точности вместимостью 1, 2, 5, 10см3 либо соответствующие самплеры, государственный стандартный образец ГСО 5237-90 состава раствора ионов цинка, 1 мг/см3, погрешность +/-1%.

Все применяемые средства измерения должны быть проверены в установленные сроки. Допускается использование других средств измерения и стандартных образцов с аналогичными или лучшими метрологическими характеристиками.

2. Реактивы: вода дистиллированная ГОСТ 6709-72, натрий 8-меркаптохинолинат 2-водный, ч.д.а. ТУ 6-09-4933-68, аскорбиновая кислота Р.73.941.09, натрий уксуснокислый трехводный, ос.ч. ТУ 6-09-1567-78, кислота азотная, х.ч. ГОСТ 4461-77, кислота уксусная, х.ч. ГОСТ 18270-72, пероксид водорода, х.ч. ГОСТ10929-76Е, 1,10-фенантролин ТУ 6-09-40-2472-87, хлороформ, ч.д.а. ТУ 6-09-4263-76, аммиак водный, х.ч. ГОСТ 3760 - 79, 8,8'-дихинолилдисульфид, ч.д.а. ТУ 6-09-16-907-84, спирт этиловый ректификованный, ГОСТ 18300-87.

3. Вспомогательное оборудование: бидистиллятор или аппарат для перегонки воды, кварцевый или стеклянный ТУ 25.11-1592-81, чашки кварцевые вместимостью 50 и 100 см3 ГОСТ 19908-90 или стакан лабораторный термостойкий вместимостью 50 и 100 см3 ГОСТ 25336-82, воронки делительные вместимостью 50 и 100 см3 ГОСТ 25336-82, воронки лабораторные ГОСТ 25336-82, фильтры обеззоленные "красная лента" ТУ 6-09-1678-86, бумага индикаторная универсальная ТУ 6-09-1181-76, электроплитка бытовая ГОСТ14919-83Е

4. Приготовление растворов

4.1. Получение бидистиллированной воды

Бидистиллированную воду получают путем повторной дистилляции воды, соответствующей ГОСТ 6709 - 72, в бидистилляторе или лабораторной установке для перегонки воды, выполненной из кварца или стекла. Все растворы готовят только на бидистиллированной воде.

4.2. 8,8'-дихинолилдисульфид, раствор в хлороформе массовой концентрации 0,2 г/дм3: 20 мг 8,8'-дихинолилдисульфида растворяют в 100 см3 хлороформа. Срок хранения раствора в холодильнике - 3 месяца.

4.3. Ацетатный буферный раствор с рН 4.6-4,9. 13,6 г уксуснокислого натрия растворяют в 100 - 150 см3 бидистиллированной воды, переносят в мерную колбу вместимостью 1000см3, приливают 5,5 см3 концентрированной уксусной кислоты, перемешивают и разбавляют до метки бидистиллированной водой. Раствор необходимо хранить в полиэтиленовой посуде, срок хранения - 3 месяца.

4.4. Раствор аскорбиновой кислоты массовой концентрации 2 г/дм3. 200 мг аскорбиновой кислоты растворяют в 100 см3 бидистиллированной воды. Срок хранения раствора в холодильнике - 3 дня.

4.5. 1,10-фенантролин, раствор в этаноле массовой концентрации 5 г/дм3. 250 мг 1,10-фенантролина растворяют в 50 см3 этанола. Срок хранения раствора - 3 месяца в холодильнике. Признаком его непригодности является появление окраски.

4.6. 8-меркаптохинолинат натрия массовой концентрации 1 г/дм3. 25 мг 8-меркаптохинолината натрия растворяют в 25 см3 бидистиллированной воды. Допускается опалесценция или помутнение раствора. Приготовленный раствор фильтровать запрещается.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - 1 сутки, в холодильнике - до 3 суток.

4.7. Раствор азотной кислоты объемной доли 0,7%. 7 см3 концентрированной азотной кислоты разбавляют до 1000 см3 бидистиллированной водой. Раствор хранят в сосуде из полиэтилена или фторопласта. Срок хранения не ограничен.

4.8. Раствор цинка массовой концентрации 100,0 мг/дм3 5 см3 ГСО 5237-90 массовой концентрации 1 мг/см3 переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, добавляют 1 см3 раствора азотной кислоты по п.4.7 и разбавляют до метки бидистиллированной водой. Срок хранения раствора - 3 месяца.

4.9. Раствор цинка массовой концентрации 1,0 мг/дм3. Раствор готовят двукратным разбавлением раствора с концентрацией 100,0 мг/дм3 (п.4.8). Для этого 10 см3 более концентрированного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 1 см3 раствора азотной кислоты по п.4.7 и разбавляют до метки бидистиллированной водой. Срок хранения раствора концентрации 10 мг/дм3 -1 месяц, концентрации 1 мг/дм3 -1 неделя.

5. Метод измерения

Флуоресцентный метод измерения массовой концентрации цинка основан на образовании комплексного соединения с 8-меркаптохинолином в среде ацетатного буфера (рН 4,6-4,9), экстракции его хлороформом и измерении интенсивности флуоресценции экстракта на анализаторе жидкости "Флюорат-02-3М". Для устранения мешающего влияния меди используют 8,8'-дихинолилдисульфид, а железа - 1,10-фенантролин.

При выполнении измерений массовой концентрации цинка необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на анализатор "Флюорат-02-3М".

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалиста, имеющего высшее или среднее специальное химическое образование или опыт работы в химической лаборатории, прошедшего соответствующий инструктаж, освоившего метод в процессе тренировки и уложившегося в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.

6. Подготовка к выполнению измерений

6.1. Отбор и приготовление проб

Подозрительные следы из пятен на вещественных доказательствах вырезают, либо смывают на нити стерильной марли. Затем помещают в пробирки с крышкам фирмы "Эппендорф", заливают 1,5 мл дистиллированной воды (рН 7,2-7,4) и экстрагируют в течение 18 часов в условия бытового холодильника (при температуре +4о С). Исследуемого материала должно быть приблизительно 50 мг.

6.2. Приготовление растворов для градуировки анализатора "Флюорат-02-3М"

В делительную воронку вместимостью 50 см3 помещают 5 см3 бидистиллированной воды, приливают 1 см3 раствора аскорбиновой кислоты по п.4.4, 5 см3 ацетатного буферного раствора по п.4.3, 1 см3 раствора 1,10-фенантролина по п.4.5 и 1 см3 раствора 8-меркаптохинолината натрия по п.4.6. ЗАПРЕЩАЕТСЯ ИЗМЕНЯТЬ УКАЗАННЫЙ ПОРЯДОК ДОБАВЛЕНИЯ РЕАГЕНТОВ. Через 2 мин приливают 5 см3 хлороформа и экстрагируют 8-меркаптохинолинат цинка в течение 1 мин. После разделения слоев нижний слой фильтруют через фильтр "красная лента" в кювету прибора "Флюорат-02-3М" (раствор N 1).

Аналогичным образом готовят раствор N 2, используя вместо бидистиллированной воды 5 см3 раствора цинка с концентрацией 1. мг/дм3 по п.4.9

6.3. Способы установления и контроля стабильности градуировочной характеристики

Градуировку прибора осуществляют путем измерения сигналов флуоресценции растворов, приготовленных по п.6.2. При градуировке прибора и всех измерениях в канале возбуждения используют светофильтр N 11, а в канале регистрации - светофильтр N 5. ". Входят в меню "Градуировка", устанавливают С0=0 и С1 =1,000. Значение параметра "JO" устанавливают по раствору N 1, а "Л" - по раствору N 2. При этом значения параметров "С2" -"С6" и "J2" - "J6" должны быть равны нулю.

Контроль стабильности градуировочной характеристики состоит в проведении измерений концентрации цинка в нескольких смесях. Приготовление образца для измерения производится согласно п.6.2. На стадии освоения методики контроль производится ежедневно перед началом измерения проб, а в дальнейшем - после замены партии реактивов, буферного раствора и стандартных образцов, но не реже 1 раза в неделю.

Градуировка признается стабильной, если полученное значение концентрации цинка в смеси отличается от известного не более, чем на 10% в диапазоне 0,5 -2,0 мг/дм3 и 20% при более низких концентрациях. При несоответствии полученных результатов указанным нормативам процесс градуировки необходимо повторить.

7. Выполнение измерений

При выполнении измерений массовой концентрации цинка должно быть выполнено приготовление экстрактов проб и измерение интенсивности их флуоресценции.

Для проведения определения отбирают не менее двух аликвотных порций исследуемого образца. Объем аликвотной порции зависит от предполагаемой концентрации цинка.

8. Обработка результатов измерений

Массовую концентрацию цинка в пробе вычисляют по формуле:

X=(Cизм-C0)/K,

где Х - концентрация цинка в анализируемом объекте, мг/дм3;

Cизм - измеренная концентрация цинка в экстракте пробы, мг/дм3;

С0 - измеренная концентрация цинка в экстракте холостой пробы, мг/дм3;

К - степень концентрирования.

Если холостую пробу не готовят, то полагают С0= 0.

9. Оформление результатов измерения

За результат анализа (X) принимают среднее арифметическое результатов параллельных определений X1 и Х2 (X=(X1+X2)/2), расхождение между которыми не превосходит значений норматива оперативного контроля сходимости d. Выбор значения d проводят по значениям X.

Результат количественного анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде: результат анализа Х (мг/дм3), (%), Р = 0,95, где - характеристика погрешности % или Х +/- , мг/дм3, Р = 0,95, где =( х Х)/100.

Результат измерений должен оканчиваться тем же десятичным разрядом, что и погрешность. Результаты измерений оформляют записью в журнале. Результаты измерений удостоверяются лицом, проводившим измерение, а при необходимости - руководителем (главным метрологом) организации (предприятия), подпись которых заверяется печатью организации (предприятия).

Результаты и обсуждение. Исследованы 10 образцов спермы заведомых доноров. В водном экстракте каждого из них удалось установить содержание цинка. Его количество составило от 4,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, то есть содержание цинка в пятнах спермы достаточно высоко, чтобы его можно было выявить с помощью описанной методики и анализатора "Флюорат-02-3М". Следовательно данный метод количественного определения цинка можно применять в практике судебно-биологической экспертизы. В дальнейшем, в случае получения положительного результата, исследуемый материал можно извлекать из пробирок и тщательно отжимать, экстракт подвергать центрифугированию в течение 5 минут при 1500-2000 об/мин. Надосадочную жидкость можно использовать для установления доказательного наличия спермы методом РИФ в количественной модификации с антиспермальными сыворотками. Из осадка можно готовить цитологические препараты, окрашивать их 0,1% раствором азур-эозиновой смеси и доказательно устанавливать присутствие спермы в данных пятнах по характерной морфологии сперматозоидов. Кусочки исследуемого материала в случае необходимости можно использовать для определения групповой принадлежности найденной спермы.

Быстрый расчет содержания цинка и документация полученных результатов могут быть обеспечены соответствующей программой для ПЭВМ.


вверх

  << Содержание

 

Альманах судебной медицины N 2 (2001), стр.

Свидетельство о регистрации сетевого электронного научного издания N 077 от 29.11.2006
Журнал основан 16 ноября 2000г.
Выдано Министерством РФ по делам печати, телерадиовещания и средств массовых коммуникаций
(c) Перепечатка материалов сайта Medline.Ru возможна только с письменного разрешения редакции

Размещение рекламы

Rambler's Top100