Медико-биологический
информационный портал
для специалистов
 
БИОМЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ Medline.ru

СОДЕРЖАНИЕ ЖУРНАЛА:
Физико-химическая биология

Клиническая медицина

Профилактическая медицина

Медико-биологические науки


АРХИВ:

Фундаментальные исследования

Организация здравохраниения

История медицины и биологии



Последние публикации

Поиск публикаций

Articles

Архив :  2000 г.  2001 г.  2002 г. 
               2003 г.  2004 г.  2005 г. 
               2006 г.  2007 г.  2008 г. 
               2009 г.  2010 г.  2011 г. 
               2012 г.  2013 г.  2014 г. 
               2015 г.  2016 г. 

Редакционная информация:
        Опубликовать статью
        Наша статистика


 РЕДАКЦИЯ:
Главный редактор

Заместители главного редактора

Члены редколлегии
Специализированные редколлегии


 УЧРЕДИТЕЛИ:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
"Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства"
(ФГБУН ИТ ФМБА России)

Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

ООО "ИЦ КОМКОН".




Адрес редакции и реквизиты

199406, Санкт-Петербург, ул.Гаванская, д. 49, корп.2

ISSN 1999-6314

Российская поисковая система
Искать: 


МАТЕРИАЛЫ ФАРМКОМИТЕТА РФ

ПРОГНОЗ КАНЦЕРОГЕННОСТИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ В КРАТКОСРОЧНЫХ ТЕСТАХ


СОСТАВИТЕЛИ:
докт. мед. наук, профессор Г.А.Белицкий, докт. биол. наук, профессор Ю.А.Ревазова, канд. биол. наук С.К.Абилев,
докт. мед. наук, профессор Е.В.Арзамасцев, канд. мед. наук О.Л.Верстакова, докт. мед. наук, профессор Т.А.Гуськова,
докт. мед. наук, профессор А.Д.Дурнев, докт. мед, наук, профессор В.С.Журков, канд. биол. наук Ф.И.Ингель,
докт. мед. наук А.Д.Куничан, канд. биол. наук И.В.Мизгирев, канд. мед, наук Л.П.Сычева,
канд. биол. наук Т.Б.Танирбергенов, канд. биол. наук Л.В.Хрипач, докт. мед. наук, докт. биол. наук, профессор В.В.Худолей,
канд. мед. наук В.В.Юрченко, Т.Е.Цуцман.

      РЕЦЕНЗЕНТЫ:
Н.Р.Дядищев, канд. биол. паук А.И.Марченко, канд. мед. наук Р.Д.Сюбаев.
      Под редакцией:
докт. мед. наук, профессора А.Г.Рудакова и член-корр. РАМН, профессора В.П.Фисенко.

1.Введение
Краткосрочное тестирование на канцерогенность следует применять в системе доклинического изучения безопасности оригинальных фармакологических средств (ФС) и вспомогательных веществ.
Вопрос о возможности перехода к клиническим испытаниям ФС, с точки зрения его канцерогенной безопасности, может решаться на основании краткосрочных скрининговых тестов (КСТ), а не после получения результатов 2-3-летних экспериментов по индукции опухолей у животных, которые в случае недостаточной эффективности ФС в клинике могут оказаться ненужными.
При отрицательных результатах в КСТ дополнительная оценка потенциальной канцерогенности на млекопитающих необходима для лекарств длительного (более 1 месяца) применения и лекарств безрецептурного отпуска. Новые фиксированные комбинации ФС, планируемые для широкого клинического приме- нения, при структурном сходстве любого из компонентов комбинации с известными канцерогенами, мутагенами или их ме- таболитами также подвергаются испытанию на млекопитающих.
Настоящие методические рекомендации имеют целью конкретизировать понятие "скрининговые экспресс-методы", тактику их использования и критерии получаемых результатов.

2. Общие положения
КСТ для выявления потенциальной канцерогенности основаны на современных данных о механизмах химического канцерогенеза [1-3]. Полный объем понятия "канцерогенные соединения" включает в себя все вещества, способные увеличивать в популяции количество опухолей различных локализаций по сравнению с соответствующим контролем. Сюда входят не только полные канцерогены, способные вызывать опухоли без дополнительных воздействий, но также инициирующие агенты, промоторы и коканцерогены. Процесс химического канцерогенеза в настоящее время условно подразделяют на две стадии: инициацию и промоцию. На первой в генетическом аппарате клетки возникают стойкие изменения; на второй, в основном за счет эпигенетических эффектов, создаются условия для преимущественной пролиферации трансформированных клеток. На стадии инициации наиболее существенным событием является повреждение ДНК высокореактивными метаболитами канцерогенов, которое приводит к возникновению точковых мутаций, перестановке блоков генов и т.д. Предполагается, что а тех случаях, когда эти события затрагивают протоонкогенные участки, последние могут активироваться и инициировать злокачественную трансформацию клетки. К такому же результату приводит и инактивация генов-супрессоров (антионкогенов). Высокая вероятность причинной связи между мутагенезом и канцерогенезом, а также высокая частота совпадения канцерогенных и мутагенных свойств среди различных химических соединений привели к созданию многочисленных тестов, в которых показателем предполагаемой бластомогенной активности служит способность вызывать генные и хромосомные мутации.
Промоторы в биологически активных концентрациях не повреждают ДНК, а оказывают плейотропное действие на клетки, изменяя, в частности, структуру и функции клеточных мембран, нарушая проницаемость межклеточных контактов. Соответственно, КСТ для выявления промоторов предназначены для выявления этих особенностей.
Одним из интегральных псказателей канцерогенной активности агента может служить его способность озлокачествлять клетки в культуре, что используется в ряде КСТ,
Для литературного поиска и анализа структурного сходства используются, во-первых, представительная база данных о мутагенных и канцерогенных свойствах широкого круга химических соединений и, во-вторых, специальные компьютерные программы [4,5]. Для анализа взаимосвязи между мутагенной активностью и химической структурой можно использовать программы CASE [6], MULTICASE [7] и ЭММА[8].
Настоящие методические рекомендации должны быть пере- смотрены через определенное время и модифицированы в со- ответствии с прогрессом Haiunx знаний о молекулярных меха- низмах химического канцерогенеэа.

Литература
1. Белицкий Г.А., Худолей В.В. Вопросы онкологии, 1986, т. 32, №4, с, 3-11.
2. Белицкий Г.А., Фонштейн Л.М., Худолей В.В. и др. Экспе- риментальная онкология, 1987, т. 9, № 3, с. 20-23.
3. Pienta R.G. In: Griffin А С., Shaw C.R. (Eds) Carcinogens: Identification and Mechanisms of Action. Rawen, New York, 1979, p. 121-141.
4. Ashby J. Two million rodent carcinogens? The role of SAR and QSAR in their detection. Mutat. Res., 1994, v. 305, p. 3-12.
5. Klopman G,, Roienkranz H.S. Approaches to SAR in carcino- genesis and miitagenesis. Prediction ofcarcinogeniciiy/mutagenic- ily using MULTI-CASE. - Mutai. Res., 1994, v. 305, p. 33-46.
6. Klopman G. Artificial intelligence approach to structure-activity studies. Computer automated structure evaluation of biological activity of organic molecules. J. .Am. Chem. Soc.,1984, v. 106, p. 7315-7321.
7. Ktopman G. MULTICASE. 1.A hierarchical computer automated structure evaluation program. Quantitative Structure-Activity Relationships, 1992 , v. 11, p. 176-184.
8. Баскип И.И., Любимова И.К., Абилев С.К. и др. Исследование количественной связи между мутагенной активностью химических соединении и их структурой. Замещенные бифе- пилы. Доклады Академии Наук, 1993, т. 332, с. 587-589.
вверх (Юридическая консультация)

3. Принципы формирования батареи КСТ и минимальная батарея КСТ
Большинство КСТ моделирует отдельные стадии канцерогенеза, поэтому наиболее успешным является их использование в виде батарей, т.е. набора тестов. Подобные батареи должны отвечать ряду требований. КСТ, включаемые в одну батарею, должны быть взаимодополняющими, т.е. отличаться или по конечному эффекту (повреждение ДНК, генные мутации, хромосомные аберрации, неопластическая трансформация, нарушение метаболической кооперации и др.) или по уровню биологической организации объекта исследования (прокариоты, эукариоты, системы in vitro, in vivo). При этом последовательность испытаний предполагает движение от простых к сложным и от кратких экспериментов к более длительным.
Отбираемые в батарею тесты должны быть надежно верифицированы на соединениях с известной канцерогенной активностью. По степени верификации различают рутинные "укоренившиеся" тесты, на которых было испытано не менее 1000 соединений, "развитые" - не менее 100 и "развивающиеся" - до 100. Эти тесты, при приемлемой стоимости и достаточной разработанности, должны быть высокочувствительными, специфичными и обладать большой пропускной способностью.
Для выявления одних и тех же эффектов существует ряд равноценных методов, которые могут взаимозаменяться. В ряде случаев, а зависимости от особенностей тестируемого соединения, одним методам следует отдавать предпочтение перед другими. Таким образом, батарея КСТ не является жестко фиксированной. Действующим началом большинства известных канцерогенов являются высокоактивные метаболиты, поэтому необходимым компонентом ряда КСТ является система адекватной метаболической активации испытуемых препаратов.
Исходя из приведенных соображений и реально освоенных методов, в настоящее время представляется приемлемой сле- дующая минимальная батарея КСТ:
А. Тесты на выявление генных мутаций.
- Тест Эймса Salmonella/микросомы с использованием экзогенной активации препаратов фракцией S9 печени крыс.
- Равнозначными тестами являются: индукция рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций или индукция соматических мутаций на дрозофиле.
Б.Цитогенетические тесты.
- Индукция хромосомных аберраций или микроядер в клетках костного мозга млекопитающих in vivo.
В.Тесты на повреждения ДНК.
- Репарационный тест на E.coli или индукция SOS-ответа бактериальной клетки, индукция внепланового синтеза ДНК в клетках млекопитающих или выявление повреждений ДНК методом флуорометрии или щелочной элюции.
Г. Тесты на лромоторную активность.
- ГФРТ-тест на нарушение метаболической кооперации в смешанной культуре соматических клеток млекопитающих.
Д.Прямые экспресс-тесты. регистрируюшие опухолеобоазующий потенциал тестируемых веществ.
- Тест на трансформацию клеток в культуре или индукцию опухолей у гидробионтов.

4. Правила продвижения исследуемых веществ по батарее КСТ и интерпретация результатов испытаний
Результаты испытания препарата в батарее КСТ позволяют сделать заключение о наличии или отсутствии канцерогенных свойств. Это заключение носит вероятностный характер, в сущности, так же, как и предсказание канцерогенной опасности вещества для человека на основании экспериментов по индукции опухолей у животных,
При оценке результатов тестирования исходят из того, что положительный эффект имеет преимущество перед отрицательным, а данные, полученные в экспериментах in vivo, более весомы, чем аналогичные, полученные in vitro. Согласно этому правилу, интегральный положительный результат системы КСТ с гораздо большей степенью вероятности свидетельствует о потенциальной канцерогенной опасности препарата, чем общий отрицательный результат об ее полком отсутствии.
С точки зрения прогноза канцерогенности, существенное значение имеют результаты, полученные в системе мутагенной оценки при учете генных мутаций (на бактериях и дрозофиле) и/или хромосомных аберраций (в клетках костного мозга мышей).
При этом могут встречаться 4 варианта сочетаний результа-TQS (табл. 1).
Таблица 1

N варианта Положительные (+) и отрицательные (-) ответы при использовании методов учета
генных мутаций на бактериях или дрозофиле хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей
1 + +
2 + -
3 - +
4 - -

В случае варианта 1 делается заключение о канцерогенной опасности и препарат не подвергается дальнейшим испытаниям. В остальных трех случаях ставятся уточняющие эксперименты: репарационный тест на E.coli или индукция SOS-ответа у бактерий, а также регистрация внепланового синтеза ДНК в культуре клеток млекопитающие или повреждений ДНК с помощью щелочной элюции.
С учетом результатов I этапа испытаний могут получиться следующие варианты сочетаний ответов (табл. 2).
Таблица 2

N варианта Положительные (+) и отрицательные (-) ответы при использовании методов учета
генных мутаций хромосомных аберраций повреждений ДНК
1 + - +
2 + - -
3 - + +
4 - + -
5 - - +
6 - - -

В случае вариантов 1, 3 и 6 дальнейшие испытания прекращаются. В случаях 1 и 3 делается заключение о наличии, а в случае б - об отсутствии канцерогенной опасности. Для отдельных групп препаратов (например, гормонов), несмотря на отрицательные ответы во всех трех группах использованных тестов (вариант 6), может оказаться необходимым применение одного из прямых экспресс тестов на опухолеобразование: трансформацию клеток в культуре или индукцию опухолей у гидробионтов.
В случаях 2, 4 и 5 переходят к следующему этапу испытаний. Стратегия работы на этом этапе связана с подтверждением или отрицанием способности исследуемого препарата индуцировать определенный тип генетических эффектов.
В случае варианта 2 (табл. 2) проводится дополнительный учет генных мутаций с помощью альтернативного метода, способного зарегистрировать этот тип эффектов. Если на первом этапе был использован, например, учет генных мутаций на бактериях, на данном (третьем) этапе работы применяются методы тестирования генных мутаций на дрозофиле или в культуре соматических клеток млекопитающих и наоборот.
В случае варианта 4 (табл. 2), эффект, полученный путем индукции перестроек хромосом или наличию микроядер в клетках костного мозга мышей, проверяется на клетках костного мозга крыс.
В случае варианта 5 (табл. 2), эффект, полученный с использованием бактерий (репарационный тест на E.coli или индукция SOS-ответа) проверяется с помощью методов учета повреждений ДНК в культуре клеток млекопитающих (индукция внепланового синтеза ДНК или учет повреждений ДНК с помощью щелочной элюции}.
При получении на данном этапе работы положительного результата в вариантах 2, 4 и 5 делается заключение о возможности наличия у исследуемого агента канцерогенной активности, связанной с индукцией определенного типа генетических эффектов. При получении отрицательного ответа переходят к заключительному этапу испытаний, связанному с использованием одного из прямых экспресс-тестов определения канцерогенной активности - учета опухолевой трансформации клеток в культуре или индукции опухолей у гидробионтов.

вверх (Юридическая консультация)

Заключение об отсутствии или наличии канцерогенной активности у исследуемого вещества делается на основании соответственно отрицательного или положительного ответа, полученного в одном из этих методов.
Испытания на про моторную активность проводятся не всегда. Они обязательны лишь в случае, если лекарственный препарат предназначен для кон тин тентов, ранее экспонированных к инициирующим злокачественный рост воздействиям: ионизирующей радиации, противоопухолевой терапии, лечению пуваленом в комбинации с Уф-облучением по поводу псориаза и др.

5. Заключение
Работу по использованию КСТ также как и экспертную оценку результатов должны проводить специалисты, имеющие достаточные профессиональные навыки по применению методов, составляющих систему тестирования.

6. Краткосрочные скрининговые тесты для прогноза канцерогенности фармакологических средств и вспомогательных веществ
6.1. Мутационный тест на Salmonella typhimurium (тестЭймса)
6.1.1. Термины и определения

Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и/или их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма. В данном тесте эти мутации могут происходить или в сайте исходной мутации, или в другом сайте хромосомы.
6.1.2. Цель исследования и принцип метода
Данный метод предназначен для выявления способности фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium.
ФС с выраженной антибактериальной активностью изучать в тесте Эймса нецелесообразно.
Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации или без метаболической активации. После инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных резертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем).
Если тестируемое соединение и/или его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у г и стидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium [1,2].
6.1.3. Процедура тестирования
6.1.3.1. Бактерии

В качестве тестерных организмов используются штаммы Sal- monella typhimurium. Минимальный набор состоит из штаммов ТА 97,ТА98 и ТА100. При необходимости могут использоваться и другие штаммы.
Каждый штамм должен быть проверен на ауксотрофность по гистидину, чувствительность к кристаллическому фиолетовому и устойчивость к ампициллину. Тестерные штаммы должны иметь уровень спонтанных ревертантов в пределах ожидаемого на основании литературных данных.
6.1.3.2. Метаболическая активация
В качестве экзогенной метаболической активации используется фракция S9 печени крыс, предобработанных соволом (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно, за 5 суток до забоя) [3].
6.1.3.3. Изучаемые дозы
Максимальная доза тестируемого соединения определяется его токсичностью и растворимостью. Токсичность тестируемого соединения может изменяться при использовании экзогенной метаболической активации. Для нетоксичных хорошо растворимых соединений максимальная доза может быть в пределах 1000-5000 мкг/чашку. Для тестируемых соединений с бактерицидной активностью максимальная доза должна подавлять рост бактерий не более чем на 50%, что определяется либо по уменьшению количества спонтанных ревертантов, либо по подавлению роста бактериального газона. В любом случае должно проверяться не менее 5 различных доз тестируемого соединения, различающихся, например, в 10 раз.
6. 1.3.4. Контроли
В каждом эксперименте обязательны одновременно проводимые негативный (необработанный или растворитель) и позитивный контроли.
В качестве растворителя используются дистиллированная вода или диметилсульфоксид, а при необходимости и другие растворители.
Позитивные контроли должны быть специфичны для каждого тестерного штамма. Позитивный контроль для вариантов с метаболической активацией должен соответствовать типу используемой системы экзогенной метаболической активации.
6. 1.3.5. Проведение эксперимента
Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда, реактивы, питательные среды и растворы, проведение работ по получению фракции S9, а также регламент работы с бактериальными культурами описаны в литературе.
Опыт параллельно ведут с использованием микросомальной активирующей смеси и без нее для регистрации действия как прямых мутагенов, так и непрямых, активность которых связана с образованием мутагенных метаболитов, учитываемых при работе с микросомальной фракцией.
В контрольных вариантах опыта вместо испытуемого образца вносят соответствующий обьем растворителя.
6.1.4. Данные и их представление
6.1.4.1. Обработка результатов

Данные должны быть представлены в виде количества ревертантных колоний на чашку. Как для тестируемого соединения, так и позитивных и негативных контролен указывается количество колоний для каждой чашки, среднее количество ревертантных колоний на чашку и стандартное отклонение. Если ни в одном из вариантов на данном штамме (штаммах) не получено статистически значимых результатов, эксперимент прекращают. В случае обнаружения позитивного результата опыт повторяют с целью подтверждения эффекта, причем работу ведут только на том штамме (штаммах), на котором был выявлен эффект. Если максимальный эффект зарегистрирован на одной из промежуточных доз (такая ситуация возможна при работе с ФС, обладающими бактерицидными свойствами), прибегают к дроблению доз. При этом за среднюю точку на шкале доз испытуемого вещества принимают дозу, на которой был выявлен максимальный эффект. В опыт вводят еще 4 варианта: дозы в 2 и 5 раз меньше и больше средней дозы.
Если при проведении повторного опыта эффект не обнаруживается, проводится еще один дополнительный опыт, результат которого сравнивают с первыми двумя экспериментами. Заключение о наличии или отсутствии мутагенной активности испытуемого соединения делают на основании двух опытов с совпадающими результатами.
Для оценки результатов тестирования могут использоваться соответствующие статистические методы, например, метод попарных сравнений Даннета [4].
6.1.4.2.. Оценка результатов
Критериями позитивного результата являются или статистически достоверное зависимое от дозы увеличение количества ревертантов, или воспроизводимый и статистически достоверный позитивный ответ по крайней мере для одной экспериментальной точки.

вверх (Юридическая консультация)

Тестируемое соединение, не вызывающее статистически достоверного зависимого от дозы увеличения количества ревертантов или воспроизводимого и статистически достоверного позитивного ответа для какой-либо экспериментальной точки, рассматривается как немутагенное в данном тесте.
Отчет должен включать следующую информацию:
- бактерии: использованные штаммы;
- условия проведения теста: уровни доз и обоснование выбора доз, количество чашек на экспериментальную точку, токсичность, состав среды, тип и состав системы метаболической активации, методика обработки, позитивные и негативные контроли;
- индивидуальные результаты для каждой культуры;
- среднее количество ревертантных колоний на чашку;
- стандартное отклонение;
- отношения доза-эффект, где возможно.
6.1.4.2.. Интерпретация результатов
Позитивные результаты в этом тесте указывают на то, что тестируемое соединение индуцирует генные мутации типа замены пар оснований или сдвига рамки считывания у данного микроорганизма. Негативные результаты в этом тесте указывают на то, что в данных условиях тестируемое соединение не мутагенно для использованных штаммов Salmonella typhimurium.
6.1.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки мутагенной активности вещества в тесте по учету генных мутаций у бактерий
Название эксперимента:
Тестерные микроорганизмы:

вид _____________ штаммы __________________
Вещество:
название _____________________________
формула, физико-химические свойства ____________
откуда получено ____________________________
растворитель ___________________________
позитивный контроль _________________________
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:

дата проведения
(начало, окончание, отдельные эксперименты) ________
способ обработки ____________ дозы ___________
количество повторностеи, количество чашек на дозу _____
система метаболической активации ______________
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:

6.1.6. Литература
1. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем (методические указания ). М., 1985, 34 стр.
2. Mciron DM., Ames B.N. Revised methods for rhe Salmonella mutagenicily test. Mutat. Res., 1983, v. 113,p. 173-215.
3. Белицкич Г.А., Фонштейн Л.М., Худолей В.В. и др. Совол как индуктор микросомальных ферментов, акчтивчрующих проканцерогены. Экспериментальная онкология, 1987, т. 9, № 3, с. 20-23.
4. Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность. Методические указания. Вильнюс, 1989.

6.2. Учет рецессивных, сцепленных с полом летальных мутаций у дроэофилы
6.2.1. Термины и определения

Летальная мутация - изменение в геноме, проявление которого приводит < смерти его носителя.
Рецессивная мутация - изменение в геноме, которое проявляется в условиях гомозиготности или гемизиготности.
Сцепленные с полом гены присутствуют в половых (X или Y) хромосомах. Обсуждаемый метод определяет мутационные события в Х-хромосоме.
6.2.2. Цель исследования и принцип метода
С помощью данного метода проводят оценку способности испытуемого вещества и продуктов его метаболизма индуцировать генные мутации в зародышевых клетках дрозофилы.
Рекомендуемый метод, называемый Меллер-5, основан на индукции исследуемыми лекарствами рецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме самцов дикого типа линии D-32. Эти мутации передаются через самок F1 самцам второго поколения, не доживающим до стадии имаго.
6.2.3. Процедура тестирования
Биология, морфология, разведение дрозофилы, а также инструменты для работы с ней и приготовление питательных сред подробно описаны в соответствующих руководствах [1].
6.2.3. 1. Используемые линии дрозофилы
Для опытов по учету рецессивных, сцепленных с полом летальных мутаций (РСПЛМ) требуется линия дикого типа с хорошо изученным спонтанным фоном мутабильности, например, Canton- S или D-32, а в качестве тестерной линии лучше всего использовать линию BASC. В Х-хромосоме мух этой линии имеются 2 инверсии sc8 и S49, которые полностью исключают возможность кроссинговера между половыми хромосомами, но не нарушают жизнеспособности дрозофилы [1]. Фенотипическими маркерами служат мутации Apricot - абрикосовые глаза и Ваг -полосковидные глаза. В подобного рода экспериментах можно использовать и другие тестерные линии.
6.2.3.2. Пути введения и выбор доз
Обычно используют два основные способа введения испытуемых ФС в организм дрозофилы: ингаляционный и пероральный (с пищей]. Чаще всего используют последний, при введении соединения в корм. В этом случае целесообразно использовать стеклянные пористые фильтры, погруженные в бюксы с веществами, растворенными в 1 -5% сахарном сиропе в исследуемых концентрациях. Если препарат нерастворим в воде, можно (при обязательном применении соответствующих контролен с растворителями) растворить его в этиловом спирте или диметилсульфоксиде так, чтобы конечная концентрация этих растворителей в сахарном корме не превышала 2%. Допускается внесение ФС непосредственно в корм. Ингаляционные затравки осуществляются в эксикаторах. Расчет доз при ингаляционном введении производят на обьем эксикатора, а при пероральном - на объем корма.
В зависимости от токсичности фармакологического средства длительность экспозиций может колебаться от нескольких часов до нескольких дней (обычно экспозиция составляет 48-72 часа). Комбинация различных концентраций и экспозиций позволяет ориентировочно определять количество ("дозу") ФС, вызывающую примерно 50% стерильность самцов. Эту "дозу" принимают за максимальную, которую используют в эксперименте. Снижение "дозы" необходимо только в случае испытаний ФС, обладающих выраженным стерилизующим эффектом,
6.2.3.3. Проведение эксперимента
После обработки изучаемым ФС самцов линии D-32 скрещивают с девственными самками тестерной линии BASC (5 самцов х 10 самок). После начала вылета мух первого поколения (F1) отбирают виргинных гетерозиготных самок и индивидуально скрещивают их с самцами F1.
После вылета второго поколения (F2), каждая культура просматривается визуально с целью обнаружения таких, в которых отсутствуют самцы дикого фенотипа (с красными глазами). Общее количество культуральных пробирок определяет число проанализированных Х-хромосом самцов, подвергшихся действию изучаемых соединений. Пробирки, в которых отсутствуют самцы дикого типа, отмечают как "рецессивные летальные мутации". Постановка контролем обязательна [2].
6.2.4. Данные и их представление
Результаты опытов представляют в виде таблицы.
Таблица 3. Учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций на дроэофиле

<
Препарат
Концентрация
Препарат
Экспозиция
Препарат
Число изученных культур в F2
Препарат
Число нефертильных самцов F2
Рецессивные сцепленные с полом летальные мутации Препарат
Уровень значимости
Количество %+(-)m
             



Частоту рецессивных летальных мутаций оценивают как отношение числа культур второго поколения без самцов дикого фенотипа к общему числу культур. Всего необходимо поставить не менее 1000 культур Рг на одну экспериментальную точку.
Для оценки значимости превышения частоты рецессивных летальных мутаций в опыте над контролем следует применять точный критерий Фишера для таблиц сопряженности 2x2. Различие между опытом и контролем считаются значимыми при р <0,01 [3].

вверх (Юридическая консультация)

6.2.5. Отчетность Протокол представления результатов оценки мутагенной активности вещества в тесте на индукцию рецессивных, сцепленных с полом легальных мутаций у дрозофилы
Название эксперимента:
Линии дрозофилы:
Вещество:

название ____________________________
формула, физико-химические свойства ____________
производитель ____________________________
растворитель ____________________________
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:

дата проведений __________________________
концентрации _____________________________
способ обработки _________________________
длительность обработки __________________
группы __________________________________
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители;
Дата сдачи отчета:

6.3.6. Литература

1. Медведев Н,И. Практическая генетика. М., Наука, 1968, 294с.
2. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. Гигиенические критерии состояния окружающей среды 51. ВОЗ, Женева, 1989, 212 с.
3. Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность. Методические указания, Вильнюс, 1989.

6.3. Учет соматической рекомбинации (мозаицизма) у дрозофилы
6.3.1. Термины и определения

Под соматической рекомбинацией понимают обмен генетическим материалом между гомологичными хромосомами соматических клеток в митозе, приводящий к образованию мозаичных особей. При использовании в качестве маркеров рецессивных генов возможно выявление генных мутаций, делеций, митотических рекомбинаций и генных конверсии.
6.3.2. Цель исследования и принцип метода
Целью данного метода является интегральное выявление рекомбинационных и других мутационных событий, индуцируемых лекарственным веществом или его метаболитами в соматических клетках личинок дрозофилы. В основе метода лежит учет мозаичных пятен, возникающих у мух тестерных линий в результате комплексного нарушения генотипа: митотической рекомбинации, потери хромосом и/или их фрагментов, транслокаций, делеций и генных мутаций. В качестве маркеров возможно использование генов "у" и "sn3" в транс-положении [1].
6.3.3. Процедура тестирования
Биология, морфология, разведение дрозофилы, а также инструменты для работы с ней и приготовление питательных сред подробно описаны в соответствующих руководствах [2],
6.3.3.1. Используемые линии дрозофилы
Для учета соматического мозаицизма в данной тест-системе необходимо поддержание следующих тестерных линий дрозофилы:
линия 1 - yellow - генотип у/у (у - рецессивный ген, обусловлизающий развитие желтой окраски тела и щетинок);
линия 2 -w, sn3 - генотип w sn3/Y (w - white - белая окраска глаз, sn3- singed3- извитая скрученная форма щетинок; оба гена рецессивные);
Спонтанный уровень мутаций и рекомбинаций невысок и колеблется у разных линий в пределах от 0,3 до 1,1%.
6.3.3.2. Пути введения и выбор доз
Обычно используют один из двух способов введения испытуемых ФС в организм дрозофилы; ингаляционный или пероральный (с кормом). Если препарат нерастворим в воде, можно (при обязательной постановке соответствующих контролен) растворить его в этиловом спирте или ди мети л сульф оксиде так, чтобы конечная концентрация этих растворителей в испытуемом растворе составляла 2%. В любом случае в культуру с кормом вносят 200 мкл тестируемого раствора. Возможно распыление нерастворимых в воде соединений по поверхности питательной среды. Ингаляционные затравки осуществляются в эксикаторах, в этом случае расчет доз производят на обьем эксикатора.
Токсичность ФС устанавливают по выживаемости самок F,, которая на максимальной из использованных концентраций не должна быть меньше 50%, Всего в эксперименте определяют эффект 3 различных концентраций ФС. В зависимости от токсичности ФС длительность экспозиций может колебаться от нескольких часов до нескольких дней (обычно экспозиция составляет 48-72 часа).
6.3.3.3. Проведение экспериментов
Девственных самок в количестве 10 особей помещают в пробирку, содержащую стандартную питательную среду, вместе с 5 самцами. Через 48-72 часа родителей пересаживают в пробирки со свежей питательной средой, а в прежние пробирки вносят растворы испытуемых ФС.
Просмотр вылетевших особей начинают с 9-10 дня после начала эксперимента и продолжают до начала вылета следующего поколения. Просмотр проводят под бинокулярным стереоскопическим микроскопом в отраженном свете.
При скрещивании самок линии 1 с самцами линии 2 у гетерозиготных самок первого поколения, имеющих генотип у + +/ 4- w sn3, регистрируют мутантные щетинки (макрохеты на голове, тораксе и скутеллюме) фенотипа yellow или singed. В протоколе регистрируют общее число просмотренных самок, число самок с одиночными (у, sn) и двойными (у sn) пятнами [1],
6.3.4. Данные и их представление
Результаты экспериментов представляют в виде таблицы
Таблица 4. Учет соматического мозаициэма при использовании маркеров "У" и "w,sn3"

<
Препарат
Концентрация/ Экспозиция
Общее число просмотренных самок Число самок с мутациями
Пятен "sn" Пятен "y" Пятен "y sn" Всего пятен %+(-)m
             



m= 1/V N, где N - число просмотренных особей
Статистическую обработку результатов проводят с использованием х2 - критерия, сравнивая частоту появления особей с пятнами в контрольных и опытных сериях [3].
6.3.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки мутагенной активности вещества в тесте на индукцию соматического мозаицизма у дроэофилы
Название эксперимента:
Линии дрозофилы, условия скрещивания;
Возраст родителей на момент скрещивания:
Вещество:

название _____________________________
формула, физико-химические свойства ____________
производитель _____________________________
растворитель ______________________________
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:

дата проведения _________________________
способ обработки _______
концентрации ________
максимальный возраст личинок на момент обработки ____
группы ______________________________
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:

6.3.6. Литература

Методические рекомендации по применению соматического мутагенеза у Dr. melanogaster в качестве тест-системы дня ускоренного определения канцерогенов. Л/3 СССР, М., 1982.
2. Медведев Н,Н. Практическая генетика. М., Наука, 1968, 294с.
3. Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность. Методические указания. Вильнюс, 1989.

6.4. Учет аберраций хромосом в клетках костного мозга млекопитающих

вверх (Юридическая консультация)

6.4.1. Термины и определения
Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.
Аберрации хромосомного типа - структурные нарушения на уровне идентичных локусов обеих хроматид, выявляемые как парные фрагменты или хромосомные обмены.
Аберрации хроматидного типа - структурные нарушения на уровне одной хроматиды, выявляемые как одиночные фрагменты или хроматидные обмены.
Ахроматические пробелы (гепы) - определяемые визуально нарушения целостности окраски хроматиды, не превышающие по размеру ее ширины и не сопровождающиеся сдвигом дистального участка относительно ее оси.
6.4.2. Цель исследования и принцип метода
Выявление и количественная оценка потенциальной цитогенетической активности ФС в клетках костного мозга млекопитающих.
В основе метода лежит регистрация видимых структурных нарушений хромосом в клетках на стадии метафазы. Клетки костного мозга характеризуются высоким уровнем митотической активности; спонтанная частота клеток с хромосомными повреждениями, включая гепы, составляет 1-2,5% [1].
6.4.3. Процедура тестирования
6.4.3.1. Лабораторные животные

Эксперименты проводят на самцах и самках мелких лабораторных грызунов. Предпочтительно использование генетически однородных животных, не менее 5 особей в каждой контрольной и экспериментальной группе.
Животные должны содержаться при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище.
6.4.3.2 Проведение эксперимента
В первой серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей суточной терапевтической для человека, и в субтоксической дозе вводят однократно только самцам с фиксацией клеточного материала через 24 часа после введения.
Во второй серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей суточной терапевтической для человека, вводят самцам и самкам ежедневно на протяжении 4-5 суток. Фиксацию клеточного материала осуществляют через 6 и/или 24 часа после последнего введения в зависимости от фармакокинетических особенностей испытуемого препарата [2].
6.4.3.3. Контроли
В качестве позитивных контролен целесообразно использовать циклофосфамид в дозе 20 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении или любой другой известный агент, заведомо обладающий цитогенетической активностью.
Негативным контролем является используемый растворитель.
6.4.3.4. Приготовление цитогенетических препаратов
Методика выделения клеток костного мозга и приготовления препаратов для цитогенетического анализа подробно описаны в соответствующих руководствах и ранее опубликованных методических рекомендациях [1-2]. Полученные препараты (два стекла от каждого животного) шифруют и подвергают микроскопическому цитогенетическому анализу.
6.4.3.5. Микроскопический анализ
Анализируют 100 метафаз от каждого животного. Анализу подвергаются округлые метафазные пластинки без наложений хромосом с модальным числом 40 - для мышей, 42 - для крыс.
Учитывают число одиночных и парных фрагментов, хроматид-ных и хромосомных обменов, ахроматических пробелов (гепов) и разрывов по центромере, число клеток с множественными повреждениями и клеток с полной деструкцией хромосом.
6.4.4. Оценка результатов
Оценку результатов цитогенетического анализа проводят путем сопоставления долей клеток с хромосомными аберрациями в контрольной и опытных сериях эксперимента. Сравнение долей клеток с гепами и разрывами по центромере следует рассматривать в качестве дополнительных критериев цитогенетической активности исследуемого препарата.
Статистическую обработку проводят согласно общепринятым рекомендациям [3]. Результаты документируются согласно таблице.
Таблица 5. Результаты оценки цитогенетической активности вещества в тесте по учету хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих

Условия экспери-мента М ы ш ь N Кол-во исследо-ванных клеток Аберрации (количество) Клетки с множес-твенными аберрациями (%) Кол-во/ Клетки (%) Доля повреж-денных клеток (%)
Одиночные фрагменты Парные фраг-менты Обмены
                 



Доказательством цитогенетической активности исследуемого препарата является статистически значимое превышение доли аберрантных клеток в опыте по сравнению с негативным контролем.
6.4.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки цитогенетической активности вещества в тесте по учету хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих
Название эксперимента:
Животные:

вид _______ линия _______ пол _____ масса _____
питомник ________________________________
дата получения _____________________________
количество ________________________________
Вещество:
название _____________________________
формула, физико-химические свойства ______________
откуда получено ____________________________
растворитель ______________________________
позитивный контроль _________________________
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:

дата проведения _________________________
путь введения ________
дозы__________________
длительность и кратность введения ________________
группы
Методика приготовления препаратов:
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:

6.4.6. Литература

1. Определение .мутагепности химических соединений (генетический скрипит) на лабораторных мышах (методические указания). М., Медицина, 1977, 12с.
2. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. Гигиенические критерии состояния окружающей среды 51. ВОЗ, Женева, 1989, 212 с.
3. Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность. Методические указания. Вильнюс, 1989.

6.5. Учет микроядер в клетках млекопитающих
6.5.1.Термины и определения

Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии ана-телофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественые микроядра в цитоплазме.

вверх (Юридическая консультация)


6.5.2. Цель исследования и принцип метода
Выявление и количественная оценка потенциальной цитогенетической активности ФС в полихроматофильных эритроцитах костного мозга млекопитающих.
Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами. Спонтанная частота клеток с микроядрами составляет 0,1-0,2% [1].
6.5.3. Процедура тестирования
6.5.3.1. Лабораторные животные

Эксперименты проводят на самцах и самках мелких лабораторных грызунов. Предпочтительно использование генетически однородных животных, не менее 6 особей в каждой контрольной и экспериментальной группе.
Животные должны содержаться при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище.
6.5.3.2. Проведение эксперимента
В первой серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей суточной терапевтической для человека, и в субтоксической дозе вводят однократно только самцам с фиксацией клеточного материала через 24 часа после введения.
Во второй серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей суточной терапевтической для человека, вводят самцам и самкам ежедневно на протяжении 4-5 суток. Фиксацию клеточного материала осуществляют через 6 и/или 24 часа после последнего введения а зависимости от фармакокинетических особенностей испытуемого препарата [1,2].
6.5.3.3. Контроли
Негативным контролем является используемый растворитель.
В качестве позитивных контролей целесообразно использовать циклофосфамид в дозе 20 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении или любой другой известный агент, заведомо обладающий цитогенетической активностью. 6.5.3.4. Приготовление патогенетических препаратов
Методика выделения клеток и приготовления препаратов для цитогенетического анализа подробно описаны в соответствующих руководствах и методических рекомендациях [1,2]. Полученные препараты (два стекла от каждого животного) шифруют и подвергают микроскопическому цитогенетическому анализу.
6.5.3.5. Микроскопический анализ
Анализируют 2000 полихроматофильных эритроцитов от каждого животного, соотношение нормо- и полихромагофильных эритроцитов определяют при подсчете 500 эритроцитов.
6.5.4. Оценка результатов
Критерием позитивного результата является воспроизводимое и статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.
Статистическую обработку проводят согласно общепринятым рекомендациям [3]. Результаты документируются согласно таблице.
Таблица 6. Результаты оценки цитогенетической активности вещества в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга млекопитающих

Группа (вещество, доза) N мыши Количество ПХЭ с микроядрами на 1000 ПХЭ Доля ПХЭ от всех эритроцитов
на каждую мышь на группу в целом
         



6.5.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки цитогенетической активности вещества в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга млекопитающих
Название эксперимента:
Животные:

вид _______ линия ________ пол ___ масса ____
питомник _____________________________
дата получения __________________________
количество ________________________
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено _____________
растворитель _______________
позитивный контроль _________________
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:

дата проведения _________
путь введения ___________дозы_______________________
длительность и кратность введения __________________
группы
Методика приготовления препаратов:
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:

6.5.6. Литература.

1. Оценка мутагениои активности химических веществ микроядерным методом (методическиерекомендации). М., 19S4, 17с.
2. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутигеипых а канцерогенных химических веществ. Гигиенические критерии состояния окружающей среды 51. ВОЗ, Женева, I9S9, 212 с.
3. Статистическая обработка данных тестирования на мушагенность. Методические указания. Вильнюс, 1989..

6.6. Репарационный тест на Escherichia coli
6.6.1. Термины и определения

Репарационный тест на Е. coli является бактериальной тест- системой для учета дифференциальной выживаемости бактерий при действии химических соединений и/или их метаболитов, индуцирующих в геноме этого организма повреждения ДНК, репарируемые в ходе эксцизионной и пострепликативной репарации.
6.6.2. Цель исследования и принцип метода
Данный метод предназначен для выявления способности фармакологических веществ и/или их метаболитов индуцировать повреждения ДНК у индикаторных штаммов Е. coli.
Репарационный тест на Е. coli основан на регистрации дифференциальной выживаемости бактерий дикого типа и мутантных бактерий, дефектных по определенным этапам репарации ДНК. Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации или без метаболической активации в жидкой среде. После инкубации в течение определенного периода времени регистрируется наличие бактериального роста у разных тестерных штаммов при одних и тех же концентрациях тестируемого соединения.
При наличии у тестируемого соединения ДНК-повреждающего действия бактериальный рост наблюдается только у штамма дикого типа.
6.6.3. Процедура тестирования
6.6.3.1. Бактерии.

В качестве тестерных организмов используются штаммы Е. coli В/r WP2 (дикий тип по репарации ДНК), WP67 (polA) и СМ571 (гесА).
6.6.3.2. Метаболическая активация.
В качестве экзогенной метаболической активации используется фракция S9 печени крыс, предобработанных соволом (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно, за 5 суток до забоя).
6.6.3.3. Изучаемые дозы (концентрации).
Максимальная концентрация тестируемого соединения определяется его токсичностью и растворимостью. Токсичность тестируемого соединения может изменяться при использовании экзогенной метаболической активации. Для нетоксичных хорошо растворимых соединений максимальная концентрация может быть в пределах 1000-5000 мкг/мл. Для тестируемых соединений с бактерицидной активностью максимальная концентрация должна подавлять рост и бактерий дикого типа, и мутантных бактерий. В любом случае должно проверяться не менее 5 различных концентраций тестируемого соединения, различающихся, например, в 10 раз. При отсутствии эффекта рекомендуется повторить тест с использованием более дробных концентраций.

вверх (Юридическая консультация)

6.6.3.4. Контроли
В каждом эксперименте обязательны одновременно проводимые негативный (необработанный или растворитель) и позитивный контроли.
В качестве растворителя используется дистиллированная вода или, в случае водонерастворимых соединений, диметилсульфоксид (конечная концентрация в инкубационной смеси не должна быть более 2,5%).
6.6.3.5. Проведение эксперимента
Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда, реактивы, питательные смеси и растворы, проведение работ по получению фракции S9, а также регламент работы с бактериальными культурами описаны в литературе [1,2].
Опыт параллельно ведут с использованием микросомзльной активирующей смеси и без нее для регистрации действия как прямых мутагенов, так и непрямых, активность которых связана с образованием мутагенных метаболитов, учитываемых при работе с микросомальной фракцией.
В контрольных вариантах опыта вместо испытуемого образца вносят соответствующий обьем растворителя.
6.6.4. Данные и их представление
6.6.4. 1. Обработка результатов

Наличие или отсутствие роста отмечается а таблице символами "+" или "-".
6.6.4.2. Оценка результатов
Производится визуально по мутности и изменению цвета индикатора.
Отчет должен включать следующую информацию:
- бактерии: использованные штаммы;
- условия проведения теста: уровни концентраций и обоснование выбора концентраций, количество культур на экспериментальную точку, состав среды, тип и состав системы метаболической активации, методика обработки, позитивные и негативные контроли;
- индивидуальные результаты для каждой культуры;
- среднее значение определений на экспериментальную точку;
- стандартное отклонение;
- отношения доза-эффект, где возможно.
6.6.4.2. Интерпретация результатов
Позитивные результаты в этом тесте указывают на то, что тестируемое соединение индуцирует повреждения ДНК у данного микроорганизма. Негативные результаты в этом тесте указывают на то, что в данных условиях тестируемое соединение не индуцирует повреждения ДНК у Е. coli.
6.6.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки генотоксической активности вещества в репарационном тесте у бактерий
Название эксперимента:
Тестерные микроорганизмы;

вид __________ штаммы _________________
Вещество:
название _________________________________
формула, физико-химические свойства ____________
откуда получено _________________________
растворитель ___________________________
позитивный контроль _________________________
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:

дата проведения (начало, окончание, отдельные эксперименты) ______________________
способ обработки ____________ дозы ___________
количество повторностей, количество культур на дозу ____
система метаболической активации ______________
Полученные результаты:
Публикации {по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:

6.6.6. Литература

1. В.А. Bridges, Simple bacterial systems for detecting mutagenic agents, Labor. Practice, 1972, v. 21, p. 413.
2. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем (методическое указание), М., 1981, стр. 21-24.

6.7. SOS-xpoMoiecTHaEscherichiacoli
6.7.1. Термины и определения

SOS-хромотест на Е. co!i является бактериальной тест-системой для учета индукции SOS-функций при действии химических соединений и/или их метаболитов, вызывающих нарушения репликации и/или повреждения ДНК в геноме этого организма.
6.7.2. Цель исследования и принцип метода
Данный метод предназначен для выявления способности фармакологических веществ и (или) их метаболитов индуцировать SOS-функции у индикаторных штаммов Е. coli [1].
В SOS-хромотесте используют штамм E.coli PQ37, в геноме которого ген lacZ (структурный ген фермента р-галактозидазы} находится под контролем промотора гена sfiA, определяющего одну из SOS-функций клетки и контролируемого генеральным репрессором SOS-системы, Экспрессия гена sfiA индуцируется после повреждения ДНК или остановке репликации как часть SOS- ответа клетки Е. coli. SOS-экспрессия колориметрически определяется по активности ji-галактозидазы.
6.7.3. Процедура тестирования
6.7.3.1. Бактерии
В качестве тестерных организмов используется штамм Е. coli PQ37. Возможно использование других штаммов.
6.7.3.2. Метаболическая активация
В качестве экзогенной метаболической активации используется фракция S9 печени крыс, предобработанных Арохлором 1254 или соволом (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно, за 5 суток до забоя).
6.7.3.3. Изучаемые концентрации
Максимальная концентрация тестируемого соединения определяется его токсичностью и растворимостью. Токсичность тестируемого соединения может изменяться при использовании экзогенной метаболической активации. Для нетоксичных хорошо растворимых соединений максимальная концентрация может быть в пределах 1000-5000 мкг/мл. Для тестируемых соединений с бактерицидной активностью максимальная концентрация должна подавлять рост бактерий не более чем на 50%. В любом случае должно проверяться не менее 10 различных концентраций тестируемого соединения, различающихся, напри мер, в 2 раза.
6.7.3.4. Контроли
В каждом эксперименте обязательны одновременно проводимые негативный (необработанный или растворитель) и позитивный контроли на штамм (например, 4-нитрохинолин-1-оксид) и систему метаболической активации (например, 2-аминоантрацен).
В качестве растворителя используется физиологический раствор с 10% диметилсульфоксидом (конечная концентрация в инкубационной смеси не должна быть более 2,5%).
6.7.3.5. Проведение эксперимента
Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда, реактивы, питательные смеси и растворы, проведение работ по получению фракции S9, а также регламент работы с бактериальными культурами с использованием анализатора "Bioscreen" описаны в литературе [2].
Опыт параллельно ведут с использованием микросомальной активирующей смеси и без нее для регистрации действия как прямых мутагенов, так и непрямых, активность которых связана с образованием мутагенных метаболитов, учитываемых при работе с микросомальной фракцией. В контрольных вариантах опыта вместо испытуемого образца вносят соответствующий объем растворителя.

вверх (Юридическая консультация)

В автоматизированном варианте SOS-хромотеста ферментативная реакция определяется в кинетическом режиме в течение 30 минут. Тест можно проводить с помощью автоматизированного микробиологического анализатора "Bioscreen" фирмы labsystems (Финляндия), управляемого ПК по программе "SOS Chrornotest". С помощью этой программы можно исследовать способность исследуемых веществ активировать SOS-систему как в условиях метаболической активации, так и без нее. В анализаторе использован принцип вертикальной фотометрии, реакция проводится в стерильных пластиковых "сотовых" плашках с оптически прозрачными дном и крышкой; возможно одновременное исследование до 3 веществ с активацией и без активации и до 8 веществ без активации. Инкубацию можно проводить как в анализаторе, так и вне его; время инкубации можно изменять.
6.7.4. Данные и их представление
6.7.4.1. Обработка результатов

Обработка результатов проводится по программе, предложенной фирмой Labsystems. Программа обработки результатов определяет для каждой концентрации исследуемого вещества отношение активности р-галактозидазы к активности щелочной фосфатазы, нормализует эти отношения на начальный момент времени и вычисляет фактор индукции. Затем автоматически строятся кривые зависимости фактора индукции от концентрации исследуемого вещества и определяется наклон кривой на ее линейной участке.
6.7.4.2. Оценка результатов
Результаты анализируют по программе " SOS Data Processing", описанной а инструкции к прибору. Получают кривые развития окраски в каждой пробе, доза-зависимые кривые для каждого исследуемого вещества и контролен и кривые изменения фактора индукции в зависимости от концентрации вещества. По их линейной части определяют SOS-индуцирующий потенциал (SOSIP).
Отчет должен включать следующую информацию:
- бактерии: использованные штаммы;
- условия проведения теста: уровни концентраций и обоснование выбора концентраций, количество культур на экспериментальную точку, состав среды, тип и состав системы метаболической активации, методика обработки, позитивные и негативные контроли;
- индивидуальные результаты для каждой культуры;
- отношения доза-эффект.
6.7.4.3. Интерпретация результатов
Позитивные результаты в этом тесте указывают на то, что тестируемое соединение индуцирует SOS-функции у Е. coli. Негативные результаты в этом тесте указывают на то, что в данных условиях тестируемое соединение не индуцирует повреждения ДНК, приводящие к индукции SOS-функции у данного штамма микроорганизмов.
6.7.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки генотоксической активности вещества в SOS-хромотесте
Название эксперимента:
Тестерные микроорганизмы:

вид ______________ штаммы ________________
Вещество:
название _____________________________
формула, физико-химические свойства ______________
производитель __________________________
растворитель ______________________________
позитивный контроль _________________________
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:

дата проведения (начало, окончание, отдельные эксперименты) ______________________
способ обработки ________
дозы
количество повторностей ______________________
система метаболической активации ______________
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:

6.7.6. Литература

1. Quillurdet P., Huisman О., D 'An R. and Hofnung M. SOS-chromotesi, ei direct assay of induction of an SOS function in Esherichia coli KI2 to measure genotoxicity. Proc. Nat/. Acad. Sci (USA), 1982, v. 79, p. 5971-5975.
2. Huttiinen T. Bioscreen Application Manual, SOS-Chromotest with Bioscreen, Labsystems Oy, Pttittilie 8, 00880 Helsinki.

6.8. Методопределения внепланового (репаративного) синтеза ДНК
6.8.1. Термины и определения

Внеплановый синтез ДНК обозначает синтез ДНК в процессе эксцизионной репарации.
6.8.2. Цель исследования и принцип метода
Для оценки потенциальной способности фармакологических препаратов индуцировать повреждения ДНК используют прямые методы, основанные на непосредственном измерении количества повреждений, и косвенные, сущность которых сводится к оценке активности ферментов репарации повреждений ДНК- Внеплановый (или репаративный) синтез ДНК осуществляется путем вырезания дефектных участков ДНК и застройки их вновь сишезированными последовательностями нуклеотидов [1].
6.8.3. Процедура тестирования
6.8.3.1. Клеточные культуры

Можно использовать первичные фибробласты человека, лимфоциты периферической крови человека, первичные гепатоциты крыс и др.
6.8.3.2. Метаболическая активация
В качестве экзогенной метаболической активации используется фракция S9 печени крыс, предобработанных соволом (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно, за 5 суток до забоя).
6.8.3.3. Изучаемые дозы (концентрации)
Используется двухэтапная схема тестирования. Используются следующие конечные концентрации: 0,1; 1,0; 10,0 и 100,0 мкг/ мл. При обнаружении эффекта только при действии одной концентрации вещества эксперимент повторяют в диапазоне концентраций в 2 и 5 раз больших и меньших (2 этап}.
6.8.3.4. Контроли
В каждом эксперименте обязательным является постановка негативного контроля, которым является растворитель.
В качестве растворителя используются дистиллированная вода или диметилсульфоксид в конечной концентрации 1% , а при необходимости - другие растворители, которые используют в концентрациях, не вызывающих токсического эффекта.
В качестве позитивных контролен используют диметилнитрозамин, метилметансульфонат и др. [2].
6.8.3.5. Проведение эксперимента
Последовательность операций, связанных с подготовкой и проведением эксперимента, а также процедура оценки полученных данных и квалификация результатов испытаний описана в соответствующих руководства [1-3].
Уровень активности ферментов репарации, индуцированный действием исследуемого вещества оценивают по включению [3Н]- тимидина в ДНК используемых культур клеток в присутствии ингибитора репликативного синтеза ДНК - оксимочеаины.
Радиоактивность измеряют с помощью жидкостно-сцинтилляционного счетчика. Показателем уровня индукции репаративной активности служит "индекс метки".
6.8.4. Данные и их представление
6.8.4.1. Обработка результатов

В каждом случае определение индекса радиоактивной метки проводят усреднением результатов, полученных в двух независимых аналогичных пробах. Статистическую обработку результатов экспериментов проводят с использованием одностороннего гомокаскадического t-критерия Стьюдента.
6.8.4.2. Оценка результатов
Согласно критериям Международной программы по стандартизации краткосрочных тестов на канцерогенность, достаточным свидетельством генотоксичности вещества в данном тесте является наличие дозовой зависимости, в которой достоверность превышения опытных величин над контрольными должна быть < 0,10 и по крайней мере в одной точке - < 0,05 [3].
Результаты документируются согласно таблице.
Таблица 7. Оценка уровня репаративного синтеза ДНК, индуцированного фармакологическим препаратом

Вариант Вещество Концентрация, мкг/мл % поврежденных клеток Индекс метки
(имп/мин/млн клеток)
Р
           

вверх (Юридическая консультация)


6.8.4.3. Интерпретация результатов
Позитивные результаты в этом тесте указывают на то, что тестируемое соединение или его метаболиты индуцируют внеплановый (репаративный) синтез ДНК. Негативные результаты в этом тесте указывают на то, что в данных условиях тестируемое соединение и его метаболиты не проявляют соответствующей активности.
6.8.5. Отчетность
Протокол представления результатов
Название эксперимента:
Клеточная линия: ___________________________
Вещество:

название _____________________________
формула, физико-химические свойства ____________
откуда получено _________________________
растворитель ______________________________
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:

дата проведения ____________________________
концентрации ______________________________
количество повторностеи на одну концентрацию
система метаболической активации _______
контроли __________
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:

6.8.6. Литература

1. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных ч канцерогенных химических веществ. Гигиенические критерии состояния окружающей среды 51. ВОЗ, Женева, 1989, 212 с.
2. Williams G.M. Summary report of the performance of the assays for DNA damage. In: Ashby J., de Serres F.J. et at. (Eds.) Progress.in Mutation Research, vol. 5, Elsevier Sci. Pub!., Amsterdam.'WHO, Geneva, 1985. P.59-6S.
3. Veniii S,, Bartsch H., Becking G. et al. DNA damage anil repair. In: Long-term and Short-term Assays for Carcinogens: A Critical Appraisal. Mnntesano R., Bartsch II., Vatnio H. et n/. (Eds.) /ARC Sci. Publ. № 83, Lyon, 19S6, p. 129-142.

6.9. Определения однонитевых разрывов ДНК клеток млекопитающих методом щелочной элюции
6.9.1. Цель исследования и принцип метода

Метод основан на определении кинетики прохождения через мембранные фильтры однонитевых фрагментов ДНК, которые образуются при денатурации ДНК в присутствии щелочи. Скорость элюции ДНК определяется скоростью денатурации ДНК, которая зависит от числа разрывов или щелочелабильных сайтов, индуцированных исследуемым соединением или его мета- болитами.
6.9.2. Процедура тестирования
6.9.2. 1. Клеточные культуры

Используют культуры постоянных клеточных линий, например, клетки легкого китайского хомячка линии V-79, клетки яичника китайского хомячка СНО или культуры мышиных клеток L.
6.9.2.2. Метаболическая активация
В качестве экзогенной метаболической активации используется фракция S9 печени крыс, предобработанных соволом (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно, за 5 суток до забоя).
6.9.2.3. Изучаемые концентрации
Используется двухэтапная схема тестирования. Используются следующие конечные концентрации: 0,1; 1,0; 10,0 и ЮО.Омкг/ мл. При обнаружении эффекта только при действии одной концентрации вещества эксперимент повторяют в диапазоне концентраций в 2 и 5 раз больших и меньших (2 этап).
6.9.2.4. Контроли
В каждом эксперименте обязательным является постановка негативного контроля, которым является растворитель.
В качестве растворителя используются дистиллированная вода или диметилсульфоксид в конечной концентрации 1%, а при необходимости - другие растворители, которые используют в концентрациях, не вызывающих токсического эффекта.
В качестве позитивных контролен используют диметилнитрозамин, метилметансульфонат и др. [1].
6.9.2.5. Проведение эксперимента
Последовательность операций, связанных с подготовкой и проведением эксперимента, а также процедура оценки полученных данных и квалификация результатов испытаний описаны в соответствующих руководствах [2]. ;
Для проведения эксперимента клетки тестерной линии пред варительно культивируют в среде Игла или RPMI 1640 с 15% инактивированной сывороткой крупного рогатого скота, содержащей меченый тритием тимидин до появления монослоя. Затем культуры инкубируют с исследуемым веществом. По истечении срока инкубации клетки снимают с подложки и перено сят на мембранные фильтры, где проводят процедуру лизиса с последующей промывкой выделенной ДНК. Затем проводят щелочную элюцию ДНК и отбор элюатов без фракционирования. Содержание ДНК в элюатах определяют в кислотонерастворимой фракции, которую сорбируют на мембранные фильтры. Радиоактивность меченого тритием тимидина, оставшуюся на фильтрах, определяют на сцинтилляционном счетчике.
Опыт параллельно ведут с использованием микросомальной активирующей смеси и без нее для регистрации действия как прямых мутагенов, так и непрямых, активность которых связана с образованием мутагенных метаболитов, учитываемых при paботе с микросомальной фракцией.
6.9.3. Данные и их представление
6.9.3.1. Обработка результатов

Полученные результаты выражают в виде % ДНК, оставшейся на фильтре. При этом используют следующую формулу:
F = AF/ (AF+AE);
,где F - % ДНК (активность в имп/мин), оставшейся на фильтре после элюции;
AF- активность, оставшаяся на фильтре; АЕ - активность, обнаруженная в элюате в пересчете на полный его обьем.
Для расчетов используют среднее арифметическое всех независимых параллелей эксперимента в том случае, если их результаты не различаются больше чем на 3 с.
6.9.3.2. Оценка результатов
Наличие у изучаемого вещества ДНК-повреждающего деиствия регистрируют при обнаружении достоверных различий между % оставшейся на фильтре ДНК в контрольных и опытных вариантах.
Достоверность различий определяют с использованием критерия Стъюдента.
Если ни в одном из вариантов не получено позитивных результатов, эксперимент прекращают. Таким же образом поступают, если обнаружен эффект с четкой дозовой зависимостью. Если эффект получен только на одной концентрации, эксперимент повторяют с использованием схемы 2 этапа.
Отчет должен включать следующую информацию:
- использованные клетки;
- условия проведения теста: уровни концентраций и обоснование выбора концентраций, количество повторностеи на экспериментальную точку, состав среды, тип и состав системы метаболической активации, методика обработки, негативные контроли;
- индивидуальные результаты для каждой параллели;
- средние значения всех показателей;
- стандартное отклонение;
- уровень значимости различий с сериями негативного контроля.

вверх (Юридическая консультация)

6.9.3.3. Интерпретация результатов
Позитивные результаты в этом тесте указывают на то, что тестируемое соединение или его метаболиты индуцируют однонитевые разрывы ДНК или щелочелабильные сайты. Негативные результаты в этом тесте указывают на то, что в данных условиях тестируемое соединение и его метаболиты не проявляют соответствующей активности.
6.9.4. Отчетность
Протокол представления результатов определения однонитевых разрывов ДНК клеток млекопитающих методом щелочной элюции
Название эксперимента:
Клеточная линия: ___________________________
Вещество:

название _____________________________
формула, физико-химические свойства ______________
откуда получено____________________________
растворитель ______________________________
контроли _________________________________
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:

дата проведения _________________________
концентрации ______________________________
количество повторностей на одну концентрацию ________
система метаболической активации ________________
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:

6.9.5. Литература

1. Williams G, M. Summary report of the performance of the assays for DNA damage. In: Ashby J., tie Serres F.J. el al. (Eds.) Progress in Mutation Research, vol. 5, Elsevier Sci. Publ., Amsterdam. WHO, Geneva, 19S5. P.59-68.
2. Venitt S., Barlsch H., Becking G. et at. DNA damage ami repair. In: Long-lerm and Short-term Assays for Carcinogens: A Critical Appraisal. Montesano R., Bartsch H., Vainio H. et al. (Eds.) IARC Sci. Publ. № 83, Lyon, 1986, p. 129-142.

6.10. Тест на угнетение метаболической кооперации в смешанной культуре клеток дляскрининга опухолевых промоторов
6.10.1. Термины и определения

TGS - клетки, чувствительные к токсическому аналогу пуриновых оснований 6-тиогуанину.
ТGR - клетки, резистентные к 6-тиогуанину вследствие отсутствия у них фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибоэилтрансферазы (ГФРТ).
В контексте данного метода промотор - агент, нарушающий проницаемость межклеточных контактов в культуре соматических клеток млекопитающих.
6.10.2. Цель исследования и принцип метода
Опухолевые промоторы снижают метаболическую кооперацию, которая сдерживает пролиферацию трансформированных (инициированных) клеток.
Цель метода - выявление способности изучаемого агента нарушать проницаемость щелевых контактов клеток для молекул фермента (ГФРТ), превращающего 6-тиогуанин в нуклеотид, включающийся в ДНК [1]. Тест применим для соединений, растворимых в питательной среде для культивирования клеток млекопитающих.
Метод основан на том, что выживаемость ТGR-клеток в смешанной культуре с TGS -клетками на среде с 6-тиогуанидином резко снижается, т.к. в ТGS5-клетках образуется нуклеотид 6-тиогуанина, который через щелевые контакты поступает в ТGR-клетки и отравляет их. Внесение в культуру агента, способного разобщать клеточные контакты, уменьшает поступление в резистентные клетки токсического 6-тиогуанина, что приводит к возрастанию выживаемости ТGR-клеток в смешанной культуре.
6.10.3. Процедура тестирования
Основным эффектом в тесте на угнетение метаболической кооперации является увеличение выживаемости резидентных к 6- тиогуанину клеток при их совместном культивировании с чувствительными вследствие угнетения межклеточного обмена токсическим метаболитом 6-тиогуанином.
6. 10.3.1. Культура клеток
В тесте используют клетки легкого китайского хомячка линии V-79 дикого типа (TGR-клетки) и мутантные ( ТGS-клетки) из банка клеток, замороженных в жидком азоте на ранних пассажах.
6.10.3.2. Изучаемые концентрации
Для выбора концентраций испытуемого вещества до постановки основного эксперимента изучается его цитотоксическое действие. На 10 чашек высевают по 5х105-10 6 ТGR-клеток. Через 4 часа после посева в среду добавляют тестируемое вещество в логарифмически снижающихся концентрациях, начиная с концентрации 100 мг/мл или 10% раствора вещества в среде, если оно жидкое. Через 72 часа культуры клеток микроскопируют. Концентрация, приводящая к гибели более 75% клеток или вызывающая выраженные морфологические изменения 75% клеток, считается токсичной. В основном опыте клетки экспонируют с последовательно уменьшающимися концентрациями вещества, начиная с концентрации, равной половине токсичной дозы.
6.10.3.3. Контроли
В качестве позитивного контроля используют известный промотор - 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (ТФА) в концентрации 5-100 мг/мл.
6.10.3.4. Проведение эксперимента.
Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда, реактивы, питательные смеси и растворы, проведение работ по получению фракции S9, а также регламент работы с культурами клеток описаны в литературе [1-3].
Для того, чтобы разделить специфическое разобщающее и неспецифическое токсическое действие тестируемого соединения, параллельно с изучением влияния соединения на метаболическую кооперацию проводят изучение его цитотоксического действия.
6.10.4. Данные и их представление
6. 10.4.1. Критерии адекватности постановки опыта.

1. Эффективность клонирования ТGR-клеток в смешанной культуре в контроле с растворителем не должна превышать 30% от эффективности клонирования ТGR-клеток s отсут- ствие ТGR-клеток в контроле с растворителем.
2. Выживаемость ТGR-клеток в смешанной культуре при обработке промотором ТФА (положительный контроль) должна быть более чем в 2 раза выше, чем в контроле с растворителем.
3. Цитотоксическое действие хотя бы 1 -2 изучаемых концентраций тестируемого соединения не должно быть выше 30%.
6.10.4.2. Оценка результатов
Данные представляют в виде количества колоний на чашку во всех группах опыта и контроля. Указывают количество колоний для каждой чашки, среднее количество на чашку и стандартное отклонение.
Эксперимент повторяют не менее 5 раз.
Определяют цитотоксическое действие всех изученых концентраций тестируемого соединения. Вычисляют в % относительную эффективность клонирования ТGR-клеток по отношению к контролю с растворителем (ЭК). Концентрации тестируемого соединения, вызвавшие снижение ЭК более чем на 30% по сравнению с контролем, при оценке влияния соединения на метаболическую кооперацию не рассматривают.
Абсолютное количество колоний ТGR-клеток, выявленное а чашках каждой группы, умножают на соответствующую данной группе ЭК.
Значимость различий выживаемости ТGR-клеток в смешанной культуре, обработанной тестируемым соединением, оценивают при помощи критерия Стьюдента.
Критериями положительного ответа являются:
- наличие достоверного увеличения относительной эффективности клонирования ТGR-клеток в культурах, обработанных тестируемым соединением по сравнению с контролем;
- высокая воспроизводимость результата (не менее чем в трех опытах из трех);
- существование зависимости "доза-эффект".

вверх (Юридическая консультация)

6.10.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки способности соединения к угнетению метаболической кооперации в смешанной культуре клеток
Название эксперимента:
Культура клеток:
Вещество:

название _________________________________
формула, физико-химические свойства ____________
откуда получено ____________________________
растворитель ___________________________
позитивный контроль _________________________
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:

дата проведения ___________________________
дозы (концентрации)_________________________
группы __________________________________
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:

6.10.6. Литература

1. Bradley M.O., Bhuyan В., Francis M.C. el al. Miitagenesis by chemical agents in V79 Chinese hamster cells: a review and analysis of the literature; a Report of the Gene-Tax Program. Mutat. Res., 1981, v. 87, p. SI-142.
2. Тест-система для оценки способности индуцировать генные мутации у млекопитающих (методическое указание). М., 1977, 17с.
3. Barren G.C., Kakunaga Т., Kuroki Т. et a!. In vitro assays that may be predictive of ntmoiir - promoting agents. In: Long-term and Short-term Assays for Carcinogens: A Critical Appraisal. Montesano R., Bansch H., Vainio H. el al, (Eds.) IARC Sci. Publ. № 83, Lyon, 1986, p. 287-302.

6.11. Тест на неопластическую трансформацию клеток грызунов в культуре ткани
6.11.1. Термины и определения

Неопластической трансформацией является процесс, в результате которого нормальные клетки приобретают способность расти в виде опухолей при перевивке их сингенным животным.
6.11.2. Цель исследования и принцип метода
Целью исследования является выявление способности испытуемого соединения превращать в культуре ткани нормальные клетки в злокачественные. Принцип метода состоит в том, что в системе быстро размножающихся соматических клеток малигнизирующие способности канцерогенов проявляются быстрее, чем а организме, где имеется иммунологический надзор.
6.11.3. Процедура тестирования
6.11.3.1. Культура клеток

Культуры соматических клеток длительно пассируют на среде, содержащей тестируемое соединение. Клетки, не обладающие собственной системой метаболической активации проканцерогенов, выращивают на монослое облученных клеток, обладающих высокой активностью метаболизирующих ферментов, или обрабатывают смесью S9 из постмитахондриальной фракции печени крыс. Колонии трансформированных клеток морфо- логически отличаются от нормальных по внешнему виду и ростовым потребностям, а также по способности давать опухоли при перевивке сингенным животным. Сравнивают количество трансформированных колоний в культурах, обработанных тестируемым соединением, со спонтанным уровнем.
6.11.3.2. Метаболическая активация
Для метаболической активации проканцерогенов готовят "кормилку", которая представляет собой монослой у-облученных клеток (10000 рад) эмбриональных фибробластов или необлученную свежеприготовленную культуру гепатоцитов взрослой крысы или мыши. Клетки "кормилки" нежизнеспособны, но они кондиционируют среду и обеспечивают метаболическую активацию проканцерогенов, к которой клетки иммортализованных линий не способны. Оптимальной является "кормилка" из первичной культуры гепатоцитов взрослых грызунов. Эмбриональные клетки первых пассажей от эмбрионов третьего триместра беременности также пригодны, но спектр активирующих цитохромов у них ограничен.
6.11.3.3. Изучаемые концентрации
Для изучения канцерогености испытуемого вещества в качестве максимальной используется минимальная токсическая доза, Для ее определения используемые для скрининга клетки сажают в лунки пластиковых плат в концентрации, обеспечивающей 30% монослоя через 48 часов. Для быстрорастущих клеток эти параметры могут быть другими, их подбирают экспериментально. Через 48 часов после посева,в лунках, кльтуральную среду заменяют средой, содержащей различные концентрации испытуемого вещества (обычно вначале с шагом 1/10, а затем 1/2, по две лунки на каждую концентрацию). Водорастворимые вещества непосредственно перед опытом растворяются в культуральной среде. Нерастворимые в воде вещества обычно растворяют в диметилсульфоксиде. Обязательно наличие контроля на растворитель и чистого контроля без каких-либо добавок (минимум по 2 лунки). Учет результатов проводят от 3-го до 7-го дня после добавлений испытуемого вещества по характеру гибели клеток.
6.11.3.4. Контроли
В каждом эксперименте необходимо наличие контролен. Негативный контроль: необработанная культура и растворитель. В качестве позитивного контроля может быть использован 20- метилхолантрен, либо другой известный канцероген, предпочтительно того же ряда, что и тестируемое соединение, испытанный ранее в культуре клеток.
6.11.3.5. Проведение эксперимента
В чашки Петри диаметром 50-60 мм на приготовленную "кормилку" высевают от 300 до 1000 клеток-мишеней и через 24 часа добавляют испытуемое вещество в концентрациях с шагом 1/2, с максимальной концентрацией, которая оказалась минимально токсичной в тесте на токсичность. Контролями служат чашки с растворителем а максимальной для данной серии концентрации (в случае ДМСО не более 0,5%), чашки без какого-либо воздействия и чашки с заранее известным канцерогеном в работающей концентрации (положительный контроль). При работе с эмбриональными клетками хомяка, клетки выращивают в течение 9 суток без замены среды, после чего культуру отмывают любым солевым раствором и окрашивают принятым в лаборатории методом. При работе с клетками иммортализован-иых клепочных линий, культуру отмывают от канцерогена через 24-48 ч или позже, а затем клетки культивируют 4-6 недель без пересева, сменяя среду 1-2 раза в неделю. После этого чашки промывают и окрашивают как и в тесте с использованием эмбриональных клеток хомяка.
6.11.4. Данные и их представление
6.11.4.1. Оценка результатов

Данные представляют в виде количества трансформированных колоний на чашку. Как для тестируемого соединения, так и для позитивных и негативных контролей, указывают число колоний для каждой чашки, среднее количество трансформированных колоний для каждой чашки и стандартное отклонение.
Все результаты должны быть подтверждены в независимом эксперименте. Для оценки результатов тестирования используют соответствующие статистические методы.
О трансформирующем действии испытуемого вещества судят по характеру колоний клеток или очагов роста. Колонии трансформированных клеток, при достаточном навыке, легко распознают по их монослойному росту, отсутствию однонаправленной ориентированности. Такие колонии состоят из резко поляризованных, перекрещивающихся, расположенных в несколько слоев клеток. Окраска их более интенсивна за счет многослойности. Клеточные штаммы, полученные из клеток таких линий, обладают пониженной чувствительностью к концентрации сыворотки в культуральной среде, образуют колонии в полужидком агаре, а при прививке сингенным животным приводят к росту у этих животных опухолей.

вверх (Юридическая консультация)

Показателем активности испытуемого вещества является соотношение колоний трансформированных клеток и нетрансформированных клеток.
Критериями позитивного результата являются или статистически достоверное, зависимое от дозы, увеличение количества трансформированных колоний, или воспроизводимый и статистически достоверный позитивный ответ no-крайней мере для одной экспериментальной точки.
6.11.4.2. Интерпретация результатов Тестируемое соединение, не вызывающее статистически достоверного, зависимого от дозы увеличения количества трансформированных колоний или воспроизводимого и статистически достоверного позитивного ответа для какой-либо экспериментальной точки, рассматривается как неканцерогенное в данном тесте.
6.11.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки способности соединения к неопластической трансформации клеток грызунов в культуре ткани
Название эксперимента:
Культура клеток:
Вещество:

название _____________________________
формула, физико-химические свойства ____________
откуда получено_________________________
растворитель______________________________
позитивный контроль_________________________
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:

дата проведения _________________________
дозы (концентрации), обоснование выбора доз, количество чашек на экспериментальную точку, токсичность, состав среды, тип системы метаболической активации, методика обработки,
позитивные и негативные контроли _________________________________
индивидуальные результаты для каждой культуры, среднее количество трансформированных колоний на чашку, стандартное отклонение, отношение доза- эффект, где возможно _______________________________
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:

6.11.6. Литература

1. LeBoetif R.A., Kerckaert G.A., Aardema M.J., Gibson D.P., Braaninger R., Isfort R.J. Миш. Res., 1996, v. 356, p. 85-127.
2. Kajiwara Y., Ajimi S., Hosokawa A., Maekawa K. Mulat. Rex., : 1997, v. 393, p. SI-90.
3. Kerckaert G.A., LeBoetif R.A., Isfort R.J. Fundam. Appl. Toxi-i col., 1996, v. 34, p. 67-72. f 4. Tsuchiya Т., Umeda M. Carcinogeitesis, 1995, v. 16, p. 1887-f 1894.

6.12. Прямой ускоренный тест выявления канцерогенности фармакологических препаратов на аквариумных рыбах Danio rerio (H)
6.12.1. Цель исследования и принцип метода

Целесоообразность использования аквариумных рыб для тестирования на канцерогенность фармакологических препаратов обусловлена такими особенностями биологии рыб, как высокая чувствительность к канцерогенным агентам, быстрое получение ответа (менее 1 года), возможность использования одновременно большого количества животных, практически полное отсутствие спонтанных опухолей, а также относительно невысокая, по сравнению с экспериментами на грызунах, стоимость тестирования. Оценку канцерогенности производят на основании анализа гистологических препаратов опухолей, которые имеют общие морфологические признаки для всех позвоночных животных [1-4].
6.12.2. Процедура тестирования
6.12.2.1. Лабораторные животные .

Аквариумные рыбы D. rerio (H), размер 2,5 - 3,5 см, масса тела 150-250 мг, продолжительность жизни в условиях лабораторий - в среднем 1,5 года. Гистологическое строение тканей рыб этого вида описано в соответствующих руководствах [5,6].
6.12.2.2. Способ введения
Как правило, применяют метод растворения препарата в воде аквариумов (иммерсия), реже используют скармливание (добавление в корм), а также подкожные, внутримышечные, внутрибрюшинные иньекции, накожную аппликацию (смазывание) и введение пилюль.
6.12.2.3. Дозы (концентрации)
Обычно при иммерсии используют концентрацию тестируемого агента, соответстветствующую 1/5 от LD50/30, установленной в подострых опытах на токсичность; в случае слабой токсичности используют максимально-переносимую дозу. Концентрацию агента а воде контролируют спектрофотометрически, при необходимости ее постоянство поддерживают путем добавления в аквариумы соответствующего количества тестируемого препарата.
6.12.2.4. Экспозиция
При тестировании канцерогенности чаще всего используют постоянную (непрерывную) экспозицию на протяжении всего периода опыта. В зависимости от физико-химических свойств препарата возможно применение пульсовой экспозиции (кратковременное, одно- или многократное содержание в воде с тестируемым агентом).
6.12.2.5. Контроли
Позитивный (опыт с маркерным канцерогеном) и негативный (необработанные или обработанные растворителем животные).
6.12.2.6. Проведение эксперимента
Используют рыб D. rerio s возрасте 3 месяца, обоего пола, содержащихся в стандартных лабораторных условиях. Оценка токсичности, схема тестирования, продолжительность тестирования, сбор материала и его гистологическая обработка описаны в соответствующих методических рекомендациях [1,2].
6.12.3. Данные и их представление
6.12.3.1. Оценка результатов

Оценка результатов тестирования выполняется на основании детального анализа гистологических препаратов. Все препараты изучают с помощью стандартной микроскопической техники. Описание каждого препарата заносится в специальный протокол, указывая характеристику обьекта, условия содержания, количество животных в опыте, динамику гибели и следующие показатели: время появления первой опухоли в группе, частота опухолей (общее число и в процентах к числу доживших до момента регистрации первой опухоли), средний латентный период развития опухолей, количество опухолевых узлов на одно животное, первичная множественность опухолей, процент злокачественных опухолей, частота метастазирования, гистологическая структура опухолей. Определяющим показателем является статистически значимое превышение числа опухолей в опыте над интактным контролем. Полученные данные подвергают статистической обработке (метод х2, критерий Стьюдента и др.).
Анализ препаратов осуществляется в соответствии с морфологическими критериями опухолевого роста, принятыми в онкологии. При этом тестируемый агент следует признать канцерогенным, если в экспериментальной группе обнаружено статистически значимое (Р<0.05) превышение количества опухолей (злокачественных и доброкачественных) по сравнению с группой негативного контроля.
6.12.3.2. Интерпретация результатов
В случае, если в экспериментальной группе не будет обнаружено изменений, которые могут быть расценены как специфические предопухолевые образования, в частности, как диффузная или нодулярная гиперплазия или появление морфологически измененных участков (усиление базофилии, уменьшение или увеличение размеров клеток, наличие патологических митозов и т.п.) и их количество будет статистически значимо превышать уровень аналогичных изменений в контроле, то тестируемый агент следует признать как потенциально канцерогенный.
Если в экспериментальной группе не будет выявлено достоверных отличий в частоте возникновения или предопухолевых изменений - тестируемый агент следует рассматривать как не обладающий канцерогенными свойствами.

вверх (Юридическая консультация)

6.12.4. Отчетность
Протокол представления результатов в прямом ускоренном тесте выявленения канцерогенноеT фармакологического препарата на аквариумных рыбах D. rerio
Название эксперимента:
Животные:

вид ______ количество ______ условия содержания _______________________
Вещество:
название _____________________________
формула, физико-химические свойства ______________
откуда получено _________________________
растворитель ______________________________
позитивный контроль _________________________
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:

дата проведения ____________________________
способ введения ________ дозы _____________
длительность и кратность введения ______________
группы ______________________________
Методика приготовления и анализа гистологических
препаратов:
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:

6.12.5. Литература

1. Использование аквариумных рыб для ускоренной оценки канцерогенной активности химических соединений. (Методические рекомендации). Минздрав СССР, 1983, 13 с.
2. Use of Small Fish Species in Carcinogen/city Testing. National Cancer Institute Monograph, 65. US Department of Health and Human Services. Bethesda, 1984, 409pp.
3. Trends in Ichthyology: An Internationa! Perspective. / Ed.J.H.Schroder, J. Baiter, M.Sharll/. GSF-Forschungcentritm; BlackweH Scientific Publications, Oxford, England. 1993, 432 pp.
4. Hawkins W.E., Walker W.W., Overstreet R.M. CarcinogenicHy Test Using Aquarium Fish. Toxicology Methods, 1995, v. 5, p. 225-263.
5. WesterfieUt M. The lebrafish book. Institute of Neurosciences, University of Oregon, Eugene, Oregon. 1993, 260pp.
6. Fournie J.W., Hawkins W.E., Krol R.M., Wolf MJ. Preparation of whole small fish for histological evaluation. In: Oslander G.K. (Ed.), Techniques in Aquatic Toxicology, 1996, CRC Lewis Publisher, p. 557-587.
Приложение
Список основных рекомендаций (указаний)
1. Тест-систем а для оценки способности индуцировать генные мутации у млекопитающих (методическое указание). М., 1977, 17с,
2. Определение мутагенности химических соединений (генетический скрининг на млекопитающих) (методические указания). М., 1977, 12 с,
3. Метод определения разрывов ДНК как тест-система для выявления мутагенного потенциала химических веществ (методическое указание), М., 1980, 11 с.
4. Тестирование химических соединений на предполагаемую канцерогенную активность по реакции репаративного синтеза ДНК в культуре клеток (методические рекомендации). М., 1982, 21 с.
5. Методические рекомендации по применению соматического мутагенеза у Drosophila melanogaster в качестве тест-системы для ускоренного определения канцерогенов. М., 1982, 24 с.
6. Использование аквариумных рыб для ускоренной оценки канцерогенной активности химических соединений (методические рекомендации). Л., 1982, 13 с.
7. Оценка мутагенной активности химических веществ микроядерным методом (методические рекомендации}. М., 1984, 17с.
8. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем (методическое указание). М.. 1985, 34 с.
9. Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность. Методические указания, Вильнюс, 1989.
10. Оценка мутагенности новых лекарственных средств. Методические рекомендации. М., 1994, 20 с.
11. Методические рекомендации по исследованию канцерогенных свойств фармакологических и лекарственных средств. Приложение к журналу "Фарматека": Ведомости Фармакологического комитета. 1998, N 1, стр. 21-24.

Свидетельство о регистрации сетевого электронного научного издания N 077 от 29.11.2006
Журнал основан 16 ноября 2000г.
Выдано Министерством РФ по делам печати, телерадиовещания и средств массовых коммуникаций
(c) Перепечатка материалов сайта Medline.Ru возможна только с письменного разрешения редакции

Размещение рекламы

Rambler's Top100