Medline.ru - Биомедицинский журнал

СОСТАВИТЕЛИ:
член-корр. РАМН, профессор Б.И.Любимов - НИИ фармакологии РАМН, канд.мед.наук Н.М.Смольникова - НИИ фармакологии РАМН,
канд.биол.наук И.В.Голованова - ЦХЛС-ВНИХФИ, канд.мед.наук А.М.Скосырева - АО Биотехнология,
канд.ед.наук Е.М.Чиркова - МНПКК Биотики, докт.мед.наук, профессор А.Г.Рудаков - Фармакологический государственный комитет Минздрава России,
канд.мед.наук О.Л.Верстакова - ГИДКЭЛ Минздрава России
РЕЦЕНЗЕНТЫ:
канд.мед.наук А.А.Голубцов (РЦДКИНВ), канд.мед.наук B.M.Иванова (ВНП БАВ),
канд.биол.наук И.А.Зеленина (МГУ им.М.В.Ломоносова), канд.биол.наук Н.М.Онацкий (НИЦ ТБП),
докт.биол.наук В.Н.Швец (НПЦ МБ), докт.мед.наук, профессор Е.В.Арзамасцев (РКНПК),
докт.биол.наук, профессор С.С.Либерман (ЦХЛС-ВНИХФИ), докт.мед.наук, профессор Т.А.Гуськова (ЦХЛС-ВНИХФИ),
канд.мед.наук Р.Д.Сюбаев (ГИДКЭЛ)

Настоящие "Методические рекомендации" составлены, с учетом многолетнего опыта работы, ряда учреждений, занимающихся изучением влияния химических соединений на процессы репродукции, анализа отечественной и зарубежной литературы, рекомендаций ВОЗ "Принци-. пы оценки риска нарушений развития плода в связи с воздействием химических веществ во время беременности", требований FDA (США), материалов СРМР (ЕС), MHW (Япония), материалов согласительной конференции от июля 1993 года по координации доклинических токсикологических испытаний в странах Европы, Японии и США.
Изучение репродуктивной токсичности включает разделы.: влияние на генеративную функцию, изучение эмбрио- и фетотоксического действия, регистрируемого в антенаталъном и по-стнатальном периодах развития, а также, при необходимости, изучение возможного неблагоприятного действия фармакологического вещества на потомство в период грудного вскармливания.

1. ИЗУЧЕНИЕ ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА ГЕНЕРАТИВНУЮ ФУНКЦИЮ

1.1. Задачей этого этапа исследований является выявление возможного отрицательного действия фармакологического вещества на стадии прогенеза (формирование мужских и женских гамет), нарушений полового поведения и транспорта продуктов зачатия.

1.2. Изучению должны подвергаться все новые оригинальные фармакологические вещества. Исключение может быть сделано для веществ с противоопухо-леой активностью, если их применение ограничивается только онкологической практикой и для веществ, рекомендуемых по жизненным показаниям.
Исследуются, также вспомогательные вещества, не разрешенные для медицинского применения.

1.3. К моменту начала тестирования необходимо располагать сведениями о физико-химических свойствах вещества, дозах (летальная, эффективная, рекомендуемая для клинических испытаний), признаках интоксикации, специфических для данного вещества, рекомендуемых способах введения, профиле фармакологического действия, показаниях и схемах применения препарата в клинике. Желательно также иметь данные о фармакокинетике фармакологического вещества.

1.4. Изучению подлежит субстанция фармакологического вещества.
В тех случаях, когда использование субстанции не обеспечивает преимущества перед лекарственной формой в отношении возможности использован ил широкого диапазона доз и удобства введения препарата экспериментальным животным, целесообразно проводить изучение репродуктивной токсичности лекарственной формы. При комбинации нескольких лекарственных веществ в одной лекарственной форме, следует изучить комбинацию в целом только в том случае, если один из компонентов в этом плане не изучен.

1.6. Изучаемое вещество необходимо вводить тем способом, который предусмотрен при клиническом применении. При пероральном способе применения вещество следует вводить зондом. Желательно предусмотреть дополнительную группу животных для выяснения обратимости эффекта в случае его обнаружения.

1.7. Исследование можно проводить как на линейных, так и па нелинейных крысах. Вещество испытывают не монее, чем в 2х-3х дозах. Дозы тестируемого вещества рассчитывают на единицу массы тела. В качестве высшей используется максимальная, при которой по отмечается выраженного токсического действия на животных. Эту дозу определяют, учитывая токсикологическую характеристику вещества (ЛД 50,кумулятивные свойства и др.) В большинстве случаев в качестве максимальной дозы может использоваться высшая доза, принятая в опытах по изучению хронической токсичности. Исключение составляют вещества, изменяющие характер своего действия при беременности. Низшая доза близка к терапевтической дозе, рекомендуемой для клинических испытаний в пересчете на животное.
Самцам препарат вводят в течение 60 дней, самкам - 15 дней. Затем животных спаривают с иитактными самками,и самцами, формируя три группы, включая интактных животных.
Рекомендуется иметь в каждой группе к началу спаривания не менее 15-20 самцов и 20-30 самок, у которых перед началом опыта проверен астральный цикл. Самок подсаживают к самцам в соотношении 2:1, сроком на 2 астральных цикла. Оплодотворение регистрируют с помощью вагинальных мазков. Половину ссаженных самок подвергают эвтаназии на IT-21 день беременности, на вскрытии подсчитывают количество желтых тел в яичниках, мест имплантаций в матке и количество живых и погибших плодов. На основании этих данных определяют уровень пред- и постимплантационной смертности зародышей.
Другую половину самок оставляют до родов и наблюдают за физическим развитием потомства до окончания вскармливания (выживаемость, масса). Пре-димплантационную смертность определяют по разности между количеством желтых тел в яичниках и количеством мест имплантации в матке; постимланта-циовную смертиость по разности между количеством мест имплантаций в количеством живых плодов. Для оценки способности к оплодотворению и зачатию вычисляют индекс, характеризующий отношение числа беременных животных к числу ссаженных в процентах.

1.8. Необходимо иметь в виду, что подавление репродуктивной функции при длительном введении некоторых фармакологических веществ может быть обусловлено не только нарушениями гаметогенеза, но в многими другими причинами (изменение эндокринной функции половых желез, гипофиза, надпочечников, поражение гипоталамуса, центров головного мозга и т.п.). Поэтому, если под влиянием тестируемого вещества возникают нарушения плодовитости животных, необходимо выяснить, зависит ли это от патологии спермато- или оогенеза, либо от других причин, - используя существующие методы выявления повреждающего действия фармакологических веществ па спермато- и оогенез. Выбор конкретных методов исследования проводится экспериментатором. Ряд рекомендуемых методов приведен в приложении.

1.9. При статистической обработке за единицу наблюдения принимают помет, т.е. результаты, полученные при вскрытии одной самки. Сведения о методах статистического анализа, использованных при обработке результатов, должны быть указаны в отчете.

2. ИЗУЧЕНИЕ ЭМБРИО- И ФЕТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ, РЕГИСТРИРУЕМОГО В АНТЕНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ РАЗВИТИЯ

2.1. Под эмбриотоксическими свойствами понимают способность того или иного вещества оказывать токсическое действие на развивающиеся зародыши. Эмбриотоксичность может проявляться как в повышении уровня эмбриональной смертности (эмбриоле-тальное действие), так и в виде анатомических, гистологических, цитологических, биохимических,, ией-рофизиологических отклонений от нормы, проявляющихся до или после рождения (тератогенное действие). Кроме того, эмбрио- и фетотоксичнсть может проявляться в изменении массы тела, краниокаудаль-ного размера плодов, задержке оссификации скелета (общая задержка развития), увеличении перинаталь-ной смертности.

2.2. Исследованию на наличие эмбриотоксических свойств должны подвергаться все новые фармакологические вещества, которые могут быть назначены женщинам в период беременности, а также все неиспользовавшиеся раннее в медицинской практике соединения, которые в качестве вспомогательных веществ включаются в лекарственную форму новых или уже применяемых лекарств. Положения, изложенные в пунктах 1.3, 1.4 должны соблюдаться и при изучении эмбриотоксического действия.

2.3. Изучаемые вещества необходимо вводить тем же способом, который предусмотрен при клиническом применении. При пероральном способе применения вещество следует вводить зондом. По возможности следует избегать внутрибрюшинного введения вещества.

2.4. Экспериментальные исследования должны включать изучение состояния плодов к концу анте-натального периода развития.

2.5. Поскольку чувствительность зародыша к токсическому действию фармакологических веществ зависит от стадии развития, и при этом зародыши, находящиеся на одной стадии развития могут различаться в чувствительности к действию различных по структуре веществ, сроки введения вещества беременным самкам должны охватывать весь период беременности.

2.6. Дозы тестируемого вещества рассчитывают на единицу массы тела самки. Наиболее целесообразным, с точки зрения последующей интерпретации результатов, следует проводить тестирование вещества, используя не менее двух-трех доз (см. п. 1.6,).

2.7. У всех без исключения млекопитающих часть , зародышей погибает до или после имплантации, а у некоторых зародышей спонтанно возникают аномалии развития. Поэтому в лабораториях, проводящих тестирование, необходимо иметь данные по так называемому "обобщенному" контролю: данные, полученные на интактных животных, использовавшихся в качестве контрольных в предыдущих исследованиях, при сохранении стабильных условий их содержания.

2.8. Основные опыты проводят на крысах. В случае необходимости получения дополнительной информации используют второй вид животных - кролики, хомяки, мини-свиньи и др. При выборе вида животного необходимо учитывать фармакокинетические параметры и видовую чувствительность изучаемого лекарственного вещества.

2.9.1 Тестирование на крысах
Каждая группа крыс, как в опыте, так и в контроле должна состоять не менее, чем из 15-20 беременных животных. Первым днем беременности считают день обнаружения сперматозоидов в вагинальном мазке. В опытах используют виргинных самок линейных, гибридных или рандомбредных животных.

2.9.2. Тестируемое вещество вводят самкам один раз в сутки, желательно в одно и то же время. При отсутствии указаний о выраженной индукции или ингиби-ровании ферментов возможно введение лекарственных веществ с 1 по 19 день беременности в 2х-3х дозах.(п.1.6) Возможна и следующая схема введения препарата: с 1 по 6 (доимплантационный период), с 6 по 16 (органогенез), и с 16 по 19 дни беременности (фетогенез). В этом случае изучаемое вещество вводят с 6 по 15 дни беременности в 2х-3х дозах, в остальные сроки можно ограничиться введением одной высшей дозы (при отсутствии эффекта). Если по техническим причинам невозможно ввести вещество в течение указанных сроков (например, при внутривенном введении), экспериментатор может воспользоваться схемой введения, предусматривающей 3-х или 4-х дневное непрерывное введение вещества, учитывая при этом условия, изложенные в п. 2.5.

Крысам контрольной группы в эти же сроки следует вводить растворители, используемые при приготовлении раствора или суспензии тестируемого вещества. Кроме того,- может быть образована группа интактных беременных самок.

В ряде случаев, по усмотрению исследователя, целесообразно использование сравнительного контроля, т.е. животных, которым вводят уже применяемый в клинической практике препарат, близкий к изучаемому по химической структуре или аналогичный по профилю фармакологического действия. Для оценки реактивности экспериментальных животных можно использовать позитивный контроль при введении животным какого-либо эталонного тератогена (салици-ловокислый натрий, циклофосфамид и др.) в дозе, оказывающей эффект примерно у 50% зародышей.

2.9.3. Во время эксперимента следует наблюдать за состоянием и поведением беременных самок, регулярно, не реже одного раза в неделю, взвешивать животных для выявления возможного токсического действия изучаемого вещества.

2.9.4. Результаты оцениваются после эвтаназии и вскрытия самок. Вскрытие проводят на 20-й день беременности. '

2.9.5. Показателями эмбриотоксичности служат: пред- и постимплантационная эмбриональная смертность, морфологические (анатомические) пороки развития, а так же общая задержка развития плодов. Предимплантационную смертность определяют по разности между количеством желтых тел в яичниках и количеством мест имплантации в матке; постимлан-тационную смертность по разности между количеством мест имплантаций и количеством живых плодов. При оценке тератогенного действия рекомендуется сначала подсчитать количество плодов с аномалиями, заметными при внешнем осмотре, а затем разделить плоды на 2 группы и у одних плодов исследовать состояние внутренних органов, у других - состояние скелета. Кроме того, плоды взвешивают и определяют их краниокаудальный размер.

2.9.6. При статистической обработке за единицу наблюдения принимают помет, т.е. результаты, полученные при вскрытии одной самки. Сведения о методах статистического анализа, использованных при обработке результатов, должны быть указаны в отчете.

2.9.7. ТЕСТИРОВАНИЕ НА КРОЛИКАХ
Исследования проводят на виргинных самках. Каждая группа (в опыте и контроле) должна состоять не менее, чем из 12 беременных крольчих.

2.9.8. Изучаемое вещество рекомендуется вводить с 6 по 18 дни беременности (период органогенеза), один раз в сутки, в высшей дозе (п.2.3.). Группы контрольных животных должны быть такими же, как указано в п.2.9.2. Вопрос о том, использовать субстанцию или лекарственную форму, решается так, как указано в п.1.4. Результаты оценивают после эвтаназии и вскрытия самок.
Вскрытие проводят на 27-28 день беременности. Можно прибегать и к хирургическому извлечению плодов у живых крольчих.

2.9.9. Показателями эмбриотоксичности служат те же показатели, что и у крыс (п. 2.9.5). Статистическую обработку результатов проводят так же, как изложено в п.2.9.6.

Исследование эмбриотоксического действия (наименование препарата) на (наименование вида животных)

Показатели Дни введения препарата

Количество беременных самок

Количество желтых тел O / O -в числителе-общее количество, -в знаменателе на одну самку

Количество мест имплантации O / O

Количество живых плодов O / O

Количество резорбций O / O

Количество мертвых плодов O / O

Предимплантационная гибель (в %)

Постимплантационная гибель
Масса плода (в %)
(в г)

Краниокаудальный размер (в мм)

Внешний осмотр плодов: количество обследованных плодов из них с аномалиями развития:
абс
% __________________
__________________
__________________

Состояние костной системы: количество обследованных плодов из них с аномалиями развития:
абс
% __________________
__________________
__________________

Состояние внутренних органов: количество обследованных плодов из них с аномалиями развития: абс
абс
% __________________
__________________
__________________

Нарушения развития, отмеченные при исследовании плодов (наименование вида животных), полученных от самок, которым вводили (наименование препарата)

Вид нарушения Группа животных (экспозиция, доза препарата)

Количество плодов, имевших данное нарушение

абс % к общему количеству обследованных по этой методике

3. ИЗУЧЕНИЕ АНТЕНАТАЛЬНОГО ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ, РЕГИСТРИРУЕМОГО В ПОСТНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ РАЗВИТИЯ.
3.1. Целью исследований, проводимых на этом этапе, является выявление нарушений эмбрионального развития, проявляющихся только в иостнатальном периоде жизни.
3.2. Исследование проводят на виргинных самках линейных, гибридных или рандомбредиых животных. Как в подопытной, так и в контрольной группах должно быть получено потомство не менее, чем от 10 самок. Изучаемое вещество вводят самкам 1 раз в сутки с б дня беременности и до родов (период органо- и фетогенеза) в дозе, близкой к максимальной (п. 1.6).
Контрольная группа самок должна получать в эти же сроки растворитель, используемый при введении препарата. Во время введения препарата необходимо регистрировать состояние и поведение самок, динамику массы тела, продолжительность беременности, течение родов. За 3-4 дня до родов беременных самок следует рассадить по одной в клетку и обеспечить их подходящей подстилкой для устройства гнезда. В каждом помете оставляют по 6-8 новорожденных (желательно одинаковое количество самок самцов). На 25- 30 день после рождения крысят отсаживают от матерей.
3.3. Исследования следует начинать вскоре после рождения, но не раньше, чем через 24 часа и, по возможности, продолжать до 2-х месячного возраста. Оценка включает следующие типы исследований: общие наблюдения за физическим развитием потомства; изучение скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания самкой; изучение двигательного и эмоционального поведения и способности к координации движений у потомства после окончания вскармливания; изучение обучаемости и памяти: выработка условных рефлексов как с положительным, так и с отрицательным подкреплением и сохранение полученных навыков. В исследованиях 1-3 типа должны быть обследованы все животные. При формировании групп для исследований 4 типа от каждого помета можно взять в группу по 2 животных. Программа изучения постнатального развития определяется экспериментатором с учетом фармакологических и токсических свойств изучаемого лекарственного вещества. Примерный перечень тестов указан в Приложении. В некоторых случаях он может быть расширен для получения дополнительной информации ( изучение влияния на клеточный состав крови, проведение биохимических, патоморфологических исследований, спаривание с последующим изучением потомства F1,F2 генераций и др.).
Необходимо иметь в виду, что введение некоторых веществ во время беременности может неблагоприятно влиять на поведение самок, приводя к нарушению лактации, угасанию материнских инстинктов и т.п. В связи с этим может возникать необходимость перекрестного вскармливания потомства.
3.4. Для некоторых фармакологических веществ, применяемых во время грудного вскармливания, желательно изучение их влияния на развитие потомства. Исследования проводят при введении вещества самкам с 1 дня после родов до окончания вскармливания (25 день). Состояние потомства оценивают, как и при изучении постнатального развития (п.3.3.).
3.5. При статистической обработке полученных результатов в качестве независимой переменной используют среднее значение соответствующего показателя для отдельного помета. В связи с этим, при формировании групп для отдельных серий испытаний желательно, чтобы соблюдалось равное представительство от каждого помета. При этом необходимо предусмотреть возможность раздельного анализа результатов для самок и самцов. В отчете должны быть представлены сведения об использовавшихся методиках статистического анализа. 4. СХЕМА ОТЧЕТА О РЕЗУЛЬТАТАХ ИЗУЧЕНИЯ ЭМБРИОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ВЛИЯНИЯ НА РЕПРОДУКТИВНУЮ ФУНКЦИЮ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА.
4.1. Представляемый в Фармакологический Государственный комитет Минздрава России отчет должен включать цифровые данные в форме таблиц, содержащих основные сведения, необходимые для суждения о наличии или отсутствии у изучаемого препарата неблагоприятного действия на внутриутробное развитие и процессы репродукции. Форма некоторых таблиц представлена в Приложении.
4.2. При описании аномалий развития следует руководствоваться общепринятой терминологией. Если трудно описать какую-либо из аномалий развития, следует представить фотографию плода с этой аномалией.
4.3. В заключительной части отчета необходимо дать оценку результатам тестирования по следующим направлениям:
- оценка результатов, полученных при изучении влияния препарата на генеративную функцию;
- оценка результатов, полученных при обследовании потомства в конце антенатального периода развития;
- оценка результатов, полученных при обследовании потомства в постнатальном периоде развития.
4.4. Общее заключение о наличии или отсутствии повреждающего действия лекарственного средства на репродуктивную функцию и внутриутробное развитие.

ПРИЛОЖЕНИЕ
1. ОСНОВНЫЕ МЕТОДИКИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ ПРИ ИЗУЧЕНИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ТОКСИЧНОСТИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ.

1.1. Эвтаназия подопытных животных и получение эмбрионального материала.
Эвтаназию самок осуществляют дислокацией шейных позвонков. Вскрывают брюшную полость, вырезают матку, переносят в чашку Петри с физиологическим раствором. Вскрывают рогя матки, подсчитывают количество живых мертвых, резервированных плодов, обследуют слизистую матки, отмечая места имплантации. Вынимают плоды, освобождают их из оболочек. В яичниках подсчитывают количество желтых тел беременности.

1.2. Наружный осмотр, взвешивание плодов.
Все живые плоды каждого помета обследуют под бинокулярным микроскопом типа МБС для обнаружения внешних видимых аномалий развития. После этого плоды навешивают, отмечают состояние каждого плода и описывают аномалии, указывают массу каждого плода и суммарную массу плодов помета.
После наружного осмотра плодов, регистрации всех аномалий и взвешивания, плоды каждого помета делят на две группы. Одну группу плодов (около 1/3) фиксируют в жидкости Буэна и используют для изучения внутренних органов. Остальных плодов фиксируют в 96' этаноле и используют для изучения состояния скелета.

1.3. Исследование внутренних органов плодов по ме- тодике Вильсона в модификации отдела эмбриологии НИИЭМ АМН СССР.
Исследования проводят на плодах, которые фиксировали в жидкости Буэпа но менее 1 недели. Плод укрепляют на пробковом столике и, при помощи безопасной бритвы, разрезом параллельно нижней челюсти отделяют голову от туловища. Первый разрез головы проводят перпендикулярно нижней челюсти непосредственно за вибрисами.На этом срезе видно состояние нижней челюсти, переднего отдела твердого неба и носовой полости. Второй разрез проводится через середину глазных яблок и охватывает обонятельные луковицы. На третьем разрезе изучают состояние головного мозга: коры больших полушарий, боковых, третьего и четвертого желудочков. Срез проводят через большой поперечный диаметр черепа. Четвертый разрез проходит параллельно третьему. Исследуют мозжечок и продолговатый мозг. Пятый разрез идет через гортань, пищевод, спинной мозг, сосуды и слюнные железы. Шестым разрезом отсекается шея от туловища. Разрез проводят перед передними лапами. Видны пищевод, трахея, спинной мозг, крупные сосуды. Седьмой разрез проходит через органы грудной клетки непосредственно за передними конечностями. На разрезе впдны: сердце, легкие, бронхи, пищевод, спинной мозг. Восьмой разрез проводят по середине между седьмым разрезом и пупочным кольцом. Осматрпвают печень, а затем осторожно удаляют ее пинцетом и исследуют состояние диафрагмы. Девятый разрез проходит ниже пупочного кольца. Видны кишечник, поджелудочная железа. Осторожно удалив петли кишечника и печень, можно наблюдать органы таза: почки, мочеточники, мочевой пузырь, прямую кишку, внутренние половые органы. Необходимо обратить внимание на почки (возможность гидронефроза), матку с придатками и тести кулы.

1.4. Метод висцерального исследования органов плодов по Стейплсу.
После внешнего осмотра живых плодов на наличие аномалий развития, определения массы и краниокаудального размера, производят декапитацию. Декапитированный плод фиксируют, глазными ножницами разрезают переднюю бргопшую стенку и грудь вдоль левого края грудины. Пинцетом удаляют вилочковую железу и исследуют топографию и состояние крупных сосудов, отходящих от сердца (правая и левая подключичные артерии, общая сонная артерия, нисходящая аорта и легочная артерия). Обращают внимание на их форму и размеры. Пинцетом фиксируют сердце за ушко правого предсердия, рассекают сердце ножницами двумя разрезами от верхушки к основанию (1-правее, 2-левес межжелудочковой перегородки) и исследуют состояние межжелудочковой перегородки и клапанов. Затем исследуют состояние легких (количество долей) и органов брюшной полости. После извлечения печени, определяют состояние диафрагмы, а удалив петли кишечника, осматривают надпочечники, почки, мочеточники и мочевой пузырь. Почки разрезают на уровне почечных лоханок и исследуют их. Определяют абсолютную и относительную массу вилочковой железы, сердца, почек. Устанавливают пол плода и изучают топографию половых органов.

1.5. Окрашивание скелета ализарином (методика Доусона, модифицированная в отделе эмбриологии НИИЭМ АМН СССР).
Плоды фиксируют в S6J этаноле не менее 7 дней. Объем спирта должен превышать объем фиксируемых плодов в 10 раз. После фиксации у плодов удаляют внутренности и погружают в 1% раствор КОН для просветления мягких тканей. Время пребывания плодов в этом растворе определяют эмпирически (примерно 1-2 суток). Когда становятся видны закладки костей, плоды вынимают, промывают водопроводной водой и перенося их в раствор А (150 мл глицерина, 300 мл дистиллированной воды и 10 г КОН), к которому добавляют несколько капель раствора Б (1% раствор ализарина красного) до появления светло-фиолетового окрашивания. Через 3-5 суток окостеневшие участки скелета окрашиваются в красно-фиолетовый цвет. Для обесцвечивания мягких тканей плоды переносят в раствор А на 7-14 дней, затем их проводят через смеси глицерина спирта и воды с целью обезвоживания (1:2:7,2:2:6,4:4:2, равные части спирта и глицерина, чистый глицерин с добавлением 1-2 капель формалина). В чистом глицерине плоды могут храниться. Плоды изучают под микроскопом МБС, учитывают аномалии скелета, количество точек окостенения в различных костных образованиях.
1.6. Методы изучения развития потомства в постнатальном периоде жизни.

Общие наблюдения за физическим развитием потомства

Дни наблюдений Регистрируемые параметры

1 2

1-2 Размер помета, число живых и мертвых новорожденных, число особей разного пола.
Вычисляется размер помета и индекс гибели.

4,7,14,21 Гибель новорожденных, масса тела.

co 2 Отлипание ушной раковины (в среднем - 2 день)

c 4 Появление первичного волосяного покрова (в среднем - 5 день)

c 6 Прорезывание резцов (в среднем - 8 день)

c 12 Открытие глаз (в среднем - 14 день)

c 23 Опускание семенников (в среднем 25 день)

c 28 Открытие влагалища (в среднем - 30 день)

Изучение скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания

Дни наблюде-ний Показатели Способ проведения опыта и регистрируемые параметры

1 2 3

со 2 Переворачивание на плоскости* Крысят кладут на спину на плоской поверхности, быстро отпускают и измеряют время, необходимое для возвращения в нормальное положение. Формирование рефлекса считается завершенным, (в среднем - на 8 день) если крысята возвращаются на все 4 лапы. Опыт проводят не более чем по 30 сек. С каждым животным до полного формирования рефлекса во всех контрольных пометах.

с 5 Отрицательный геотаксис* Опыт проводят 1 раз в день, по 1 минуте. Крысят помещают на наклонную плоскость (25°) головой вниз. Рефлекс считается сформированным, если крысята поворачиваются на 180° (в среднем - 7 день). Можно измерять время удержания на наклонной плоскости. Опыты проводят до полного формирования рефлекса во всех контрольных пометах.

с 6 Избегание обрыва* Крысят кладут на стол, или возвышающуюся над клеткой платформу таким образом, что передние лапы касаются края стола. Формирование рефлекса завершено (в среднем - 9 день), если в течение 10 сек. Крысята отползают от края площадки. Опыт проводят до полного формирования рефлекса во всех контрольных пометах.

6-8 Маятниковый рефлекс

Открытое поле Определяется как изменение направления головы и туловища в горизонтальной плоскости приблизительно на 90° за счет перемещения передних лап, когда задние конечности поджаты и неподвижны. Измеряется количество поворотов за 1 мин. и количество изменений направления на обратное (реверсия).
Крысят помещают на площадку, размерами 30x30 см, на которой проведены линии, образующие 36 квадратов.
Регистрируют:

8-9 Поднимание головы и передних лап.

9-11 Ползание

13-15 Опору на задние конечности, подъем всего тела

17-20 Двигательную активность (число пересеченных квадратов), умывания различного рода, обнюхивания, стойки, карабканье на стенки, прыжки, время отсутствия активности, возможные аномалии походки.

c 8 Реакция на акустический стимул* Крысят помещают на небольшую площадку в звукоизолированной клетке. Поворот площадки или движение животного можно регистрировать автоматически или визуально. Рефлекс считают сформированным если животное реагирует на акустический стимул длительностью 0,3 - 0,5 сек. (в среднем формируется на 13 день). Опыты проводят до полного формирования рефлекса во всех контрольных пометах.

с 14 Зрачковый рефлекс* Регистрируют сокращение зрачка или поворот головы. Опыт проводят в затемненном помещении с точечным источником света до полного формирования рефлекса во всех контрольных пометах (в среднем - 14-15 день).

14-15 Избегание обрыва (вызванное визуальным стимулом) Животное помещают на площадку, поднятую на высоту 45 см над поверхностью. Избегание падения принимается за положительное решение. Опыт проводят однократно, после открытия глаз.

10-11 Обонятельная реакция Животное помещают посредине рейки, шириной 6 см с делениями, которую кладут на клетки. Расстояние между клетками можно менять. Определяют расстояние, на котором животное правильно выбирает направление на клетку с сибсами и матерью, в которой оно содержалось перед опытом. Средний возраст формирования рефлекса (10 - 11 день). Можно учитывать число падений, соскальзываний, совмещая этот тест с тестом хождения по полоске.

с 15 Мышечная сила* Животное помещают на густую проволочную сетку, которую медленно поворачивают на 1800. Измеряют время нахождения животного под сеткой, которое должно висеть на сетке не менее 15 сек. Опыты проводят до достижения критерия всеми контрольными пометами.

Исследование эмоционально-двигательного поведения и способности к тонкой координации движений

17-20 Переворачивание в свободном падении Крысят держат спиной вниз на высоте 60 см над мягкой поверхностью и быстро отпускают. Визуально регистрируют, переворачиваются ли крысята в воздухе, чтобы упасть на все 4 лапы.

14-25 Удержание на вращающемся цилиндре* Изучают время удержания на вращающемся цилиндре {при скорости 30 об/мин). Испытания проводят до достижения критерия-удержания в течение 3 мин. на цилиндре с резиновой поверхностью и диаметром приблизительно 12 см. Сложность задачи можно варьировать, уменьшая диаметр цилиндра и его текстуру, а также скорость вращения. Опыты проводят до достижения критерия всеми контрольными животными.

40-45 Открытое поле - 2 Испытания проводят в 3-х минутных тестах на протяжении 3-4 дней, либо, при большом количестве животных, (более 60) один день при длительности теста не менее 3-х мин. Крыс помещают в центр ярко освещенной площадки, разбитой на квадраты. Регистрируют время выхода из центра (латентный период), число посещаемых квадратов {двигательная активность), число стоек (реакция оглядывания), число умываний различного типа (грумминг), число актов дефекации и мочеиспускания (эмоциональность).

30-45 Спонтантная двигательная активность Измерение двигательной активности может быть проведено одним из альтернативных двигательная методов анализа: "беличье колесо", систем с фотоэлектрической и магнитной активность регистрацией и т.п.

Примечание: * - эти показатели можно изучать не в динамике, а однократно, в предполагаемый день созревания рефлекса у контрольных животных.

Изучение обучаемости и памяти

Способ проведения эксперимента Регистрируемые параметры

1 2

Пасивное избегание с отрицательным (болевым) подкреплением

Методика основана на естественной для крыс реакции, большей частью на стремлении переходить из освещенной камеры в темную. Крыс помещают в освещенную камеру размером 40x20x20 см. В 1 день обучения животные в темной камере получают электроболевое раздражение при силе тока 1 мА. Через 24, 48 часов исследуют время нахождения животных в освещённой камере (обычно не более 2-3 мин.). Относительное число животных, не избегающих светлой камеры.
Латентный период выхода в темную камеру при первом предъявлении.
Латентный период выхода в темную камеру через 24, 48 часов после обучения.

Активное избегание с отрицательным (болевым) подкреплением

Проводится обычно в т.н. челночной камере, состоящей из двух отсеков, размером 20*20*20см и разделенных переходом или дверцей. В полу камеры решетки, на которые можно подавать ток силой 0,75-1,5мА (обычно определяют болевой порог ндивидуально для каждого животного и используют ток, равный 1,5 болевого порога). Обучение методом дискретных проб заключается в том, что каждое испытание начинается с сигнала (зуммер, свет). Если животное через фиксированное время (5-10 сек.) не переходит в безопасный отсек, подается электроболевое раздражение. Опыты проводят до достижения критерия обученности не менее чем у 80% животных контрольной группы. Критерием обученности является 18 успешных избеганий в серии из 20 опытов. Крыс обучают двухстороннему избеганию. При изучении долгосрочной памяти (например: 1, 7, 10 дней после достижения критерия) животным подвергают однотипным с обучением испытаниям. Угасание навыка исследуют каждый день, не подкрепляя сигнал болевым раздражением. Возможны модификации метода выработки этого рефлекса: одностороннее избегание, массированное обучение. Среднее количество правильных ответов в зависимости от числа предъявлений.

Кривая обучаемости - относительное число животных, достигших критерия обученности при данном числе испытаний.

Среднее значение болевого порога.

Среднее число межсигнальных реакций.

% ошибочных ответов при исследовании памяти.

Скорость угасания навыка.

Обучение в лабиринте с положительным (пищевым) подкреплением

Используют Т-, У-образные лабиринты, или многосекционные лабиринты.
Животных взвешивают до начала ограничения в питании, после первого дня испытания и после достижения критерия обученности.
Опыты продолжают до достижения критерия, подбираемого эмпирически при анализе кривой обученности.
Опыты продолжают до достижения критерия не менее чем 80% животных контрольной группы.
При отсутствии различий в скорости обучения, исследуют память обученных животных.
При исследовании памяти необходимо, чтобы животные получили в процессе обучения сходное количество подкреплений. Среднее количество правильных ответов в зависимости от числа предъявлений.

Кривая обученности.

Частота (и длительность) различных актов поведения, в том и эмоциональная реакция на лабиринт.

Число различных элементарных актов поведения до достижения критерия обученности.

Потеря массы тела в процессе обучения и корреляция этого показателя со скоростью приобретения навыка.

1.7. Для морфологического изучения семенников их фиксируют в 10% формалине или жидкости Карнуа, заливают в парафин, приготовляют поперечные срезы толщиной 6-7 микрон, окрашивают гематоксилином и эозином. Морфологическую оценку состояния сперматогенного эпителия проводят по следующим количественным показателям:
а) индекс сперматогенеза=сумма A/100, где А- сумма чисел стадий в каждом канальце, 100 - число подсчитанных канальцев. Индекс сперматогенеза подсчитывают по 4- х бальной системе, фиксируют в канальце наличие сперматогоний, сперматоцитов 1 и 2 порядка, сперматид и сперматозоидов;
б) среднее количество нормальных сперматогоний в каждом канальце (подсчитывают 20 канальцев);
в) относительное количество канальцев с 12-й стадией мейоза (метафаза 2-го деления созревания, подсчитывают в 100 канальцах).
Для исследования функционального состояния сперматозоидов обычно используют суспензию, полученную при продольном разрезе придатка семенника.
Методика стандартизована по количеству (2мл) физиологического раствора и времени перемешивания (2мин) при комнатной температуре. Это позволяет проводить оценку функции сперматозоидов по следующим показателям: характер и продолжительность их движения; относительное количество патологических форм сперматозоидов; концентрация сперматозоидов в хвостовой части эпидидимиса. Возможно также определение относительного количества живых сперматозоидов и их резистентности осмотической и кислотной.

1.8. Для морфологического изучения яичников их фиксируют в жидкости Карнуа, заключают в парафин, приготовляют срезы по типу топографических, через весь орган, толщиной 6 микрон, окрашивают гематоксилином и эозином. Эвтаназию животных проводят в стадии эструс или проэструс, что необходимо для последующего подсчета структурно-функциональных элементов в яичнике.
Регистрируют:
- примордиальные фолликулы и фолликулы с одним слоем гранулезных клеток; фолликулы с двумя и более слоями гранулезных клеток;
- зрелые фолликулы (граафовы пузырьки);
- атретические тела и атрезирующие фолликулы;
- желтые тела;
- общее количество генеративных форм.
Указанные элементы подсчитывают по всей поверхности среза. Фолликулы примордиальные и с одним слоем гранулезных клеток учитывают в каждом 10 срезе и результат умножают на 10, фолликулы зрелые с двумя и более слоями гранулезных клеток, атретические тела подсчитывают в каждом 5 срезе, желтые тела фиксируют в срединном срезе. При количественной оценке микроструктуры яичника регистрируют только фолликулы, содержащие ядро и ядрышко.

Список литературы:
1. Гуськова Т.А. Оценка безопасности лекарственных средств на стадии доклинического изучения. Химико- фармацевтический журнал, 1990, 7, стр.10-15.
2. Кирющенков А.П., Тараховский М.Л. Влияние лекарственных средств на плод. Москва,1990, 286с.
3. Методические указания по изучению эмбриотоксического действия фармакологических веществ и влияния их на репродуктивную функцию. Москва, Фармакологический комитет, 1986, 25 с.
4. Принципы оценки риска для потомства в связи с воздействием химических веществ в период беременности. ВОЗ.Женева, 1986 156 с.
5. Торчинский A.M. Доклиническое изучение тератогенных свойств лекарственных препаратов: возможности увеличения информативности результатов эксперимента. Докт. дисс. Москва, 1990.
6. Beltrame D., Mazue J. Reprodactive toxicology guidelines:comparison and application. Ann. 1st. Super Sanita, 1993, v.29, 1,3-4.
7. ICH Harmonised Tripartite Guideline Recommended for Adoption at Step 4 of the ISH Process on 24 June 1993 by the ICH Steering Committee.