Медико-биологический
информационный портал
для специалистов
 
БИОМЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ Medline.ru

СОДЕРЖАНИЕ ЖУРНАЛА:
Физико-химическая биология

Клиническая медицина

Профилактическая медицина

Медико-биологические науки


АРХИВ:

Фундаментальные исследования

Организация здравохраниения

История медицины и биологии



Последние публикации

Поиск публикаций

Articles

Архив :  2000 г.  2001 г.  2002 г. 
               2003 г.  2004 г.  2005 г. 
               2006 г.  2007 г.  2008 г. 
               2009 г.  2010 г.  2011 г. 
               2012 г.  2013 г.  2014 г. 
               2015 г.  2016 г. 

Редакционная информация:
        Опубликовать статью
        Наша статистика


 РЕДАКЦИЯ:
Главный редактор

Заместители главного редактора

Члены редколлегии
Специализированные редколлегии


 УЧРЕДИТЕЛИ:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
"Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства"
(ФГБУН ИТ ФМБА России)

Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

ООО "ИЦ КОМКОН".




Адрес редакции и реквизиты

199406, Санкт-Петербург, ул.Гаванская, д. 49, корп.2

ISSN 1999-6314

Российская поисковая система
Искать: 


ТОМ 5, СТ. 78 (стр. 231-234) // Июнь 2004

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРФТОРУГЛЕРОДОВ ДЛЯ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ПРОЦЕССОВ МИКРОБНОЙ ДЕГРАДАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ НА ПРИМЕРЕ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

М.К. Бакулин, Е. В. Чеботарев, А. С. Кучеренко
Вятский государственный университет, Киров


Нефть относится к наиболее интенсивно используемым природным полезным ископаемым. Процессы добычи, транспортировки, переработки нефти и использования нефтепродуктов часто сопровождаются технологическими и аварийными выбросами их во внешнюю среду, что приводит к загрязнению и нарушению экосистем различной интенсивности, вплоть до экологических катастроф. Площади нефтезагрязненных земель и водоемов с каждым годом увеличиваются, поэтому продолжает оставаться актуальной проблема разработки новых и совершенствования существующих технологий ликвидации последствий техногенных контаминаций нефтью и нефтепродуктами и восстановления биопотенциала нарушенных экосистем [1].

Экономический эффект, получаемый в результате реабилитации природного потенциала при очистке от нефтяных загрязнений одного гектара земли, изымающейся из пользования в результате аварийных выбросов нефтепродуктов, составляет несколько десятков тысяч долларов (в зависимости от структуры землепользования, для пахотных земель - 30000 долларов, для пастбищных и сенокосов - 200000 долларов, для промышленных районов - 2335000 долларов) [2].

В последние годы появилось много публикаций об эффективном использовании микроорганизмов для удаления экотоксикантов на основе нефти [2 - 4]. Механизмы микробной биодеструкции нефти и нефтепродуктов самые разнообразные: от биотрансформации под воздействием разнообразных ферментов, до полной утилизации и использования в качестве источника углерода и энергии. С учетом таких способностей микроорганизмов был предложен метод биокоррекции загрязнений, который включает в качестве основных подходов биостимуляцию - активацию деградирующей способности аборигенной микрофлоры почвы или воды, путем внесения биогенных элементов, и биодополнение - интродукцию в загрязненные нефтепродуктами очаги специализированных микроорганизмов.

Основные преимущества микробиологической деструкции перед другими методами заключаются: в более полной степени очистки, экологической безопасности, относительной дешевизне, возможности постоянной обработки "хронических" загрязнений и возможности использования в зонах труднодоступных для выемки грунтов.

Еще недавно предполагалось, что микроорганизмы, способные разлагать и использовать углеводороды нефти и нефтепродуктов, встречаются только там, где расположены нефтепромыслы, нефтехранилища или нефтепроводы, т. е. только там, где имеются источники постоянного загрязнения ими внешней среды. Однако, согласно современным данным, такие микроорганизмы распространены очень широко и могут быть выделены из любой луговой, лесной, полевой почвы [2-4]. Кроме того, способность использовать нефть в качестве источника энергии присуща не только конкретным специализированным формам микробов, а широкому кругу бактерий и микроскопических грибов.

К биодеструкторам нефтепродуктов относят значительное число микроорганизмов представителей разных таксономических групп: псевдомонад, бацилл, родококков, микобактерий, дрожжевых микромицетов и других микробов. Всем этим микроорганизмам при росте на углеводородах нефтепродуктов крайне необходим кислород.

Предельные скорости транспорта кислорода в средах, содержащих высокие концентрации углеводородов, часто остаются недостаточными в отношении микроорганизмов нефтедеструкторов, что существенно ограничивает скорость и степень биодеградации нефти и нефтепродуктов. С учетом этого нами было использовано внесение в среды разных концентраций перфторорганического соединения (ПФОС) с газотранспортной функцией - перфтордекалина. При этом ПФОС нас заинтересовали из-за своей химической устойчивости и большой способности растворять газы. Известно, что они растворяют до 40-50 об. % кислорода и до 150-200 об. % углекислого газа и способны доставлять их клеткам и тканям организма [5].

Цель данной работы заключалась в экспериментальном обосновании перспективности использования перфторорганических соединений с газотранспортной функцией для ускорения процессов биодеградации нефти и выращивания микроорганизмов биодеструкторов на синтетических средах содержащих только воду, соли, а в качестве источника углерода и энергии нефть или нефтепродукты, что позволяет адаптировать биодеструкторы для интродукции в места нефтезагрязнений.

В качестве биодеструкторов нефтепродуктов были использованы выделенные сотрудниками лаборатории микробиологии ВятГУ культуры углеводородокисляющих бактерий родов Pseudomonas, Rodococcus и Bacillus [6]. Характеристика основных культурально-морфологических свойств использованных штаммов представлена в табл. 1.

Таблица 1. Свойства штаммов бактерий биодеструкторов

Штамм

Характеристика клеток

Характеристика колоний

Отношение к кислороду

Форма

окраска по Граму

Подвиж­ность

форма

цвет

Pseudomonas putida

ВУ186

Палочки с закруглен-
-ными концами

Г-

Подвижны

Круглые, выпуклые, край ровный

Светло- серый или кремовый

Аэробы

Rhodococcus erythropolis

ВУ 321

Палочко-
-видные, закруглен-
-ные концы

Г+

Неподвижны

Круглые, выпуклые, край ровный

Бледно-бежевые

Аэробы

Bacillus

subtilis

ВУ 367

Палочки с  закруглен-
-ными концами

Г+

Подвижны

Круглые, выпуклые, край ровный

Белые или светло серые

Факульта­тивные анаэробы


Для выращивания углеводородокисляющих микроорганизмов, использовали синтетическую минеральную среду следующего состава (г/л): аммоний фосфорнокислый однозамещенный - 9,0; натрий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0; калий фосфорнокислый двузамещенный - 10,0; кальция хлорид - 0,04; магний сернокислый семиводный - 0,7; железо сернокислое семиводное - 0,013; цинк сернокислый семиводный - 0,012; марганец сернокислый семиводный - 0,012; воды водопроводной до 1 дм3, рН среды 6,9+0,1. Навески солей растворяли в воде раздельно и смешивали после стерилизации в асептических условиях, затем доводили рН среды до заданных значений.

В стерильные колбы Эрленмейера емкостью 250 см3 вносили: навески 0,5 г (1 % по массе) нефти или мазута; 0,5 или 2,5 см3 перфтордекалина (1 и 5,0 об.%); культуру одного из микроорганизмов биодеструкторов в объеме 1 см3 с концентрацией 5.109 бактерий/см3 по оптическому стандарту мутности (ОК), а затем готовой синтетической средой доводили общий объем рабочей смеси до 50 см3 (до конечной концентрации в рабочей суспензии 1.108 живых бактерий в 1 см3 по ОК). Одновременно ставили контрольные опыты с колбами, в которых отсутствовал один из исследуемых компонентов: нефтепродукт, культура микроорганизмов или перфтордекалин, а также определяли биологическую концентрацию (количество живых) бактерий в среде путем высева серийных разведений культуры на плотную среду на основе мясопептонного агара.

Колбы помещали на шуттель, выращивание культур вели в течение 4 суток при (29+2)°С и 250 оборотах в минуту. Для сравнения характера роста бактерий при нормальном углеводном питании с культурой Pseudomonas putida ВУ186 был поставлен эксперимент, когда в жидкую синтетическую среду вместо нефтепродуктов добавили стерильный раствор глюкозы до конечного содержания ее в среде 0,5 г (1%).

Количественное определение нефтепродуктов в среде после культивирования проводили гравиметрическим (весовым) методом. Метод достаточно прост, не требует сложного дорогостоящего оборудования. Недостатком метода считается относительно большая погрешность при обнаружении легких фракций углеводородов. Для преодоления этого недостатка, в схему анализа была включена контрольная проба, представляющая собой смесь питательной среды с эквивалентным количеством нефтепродукта и проводимая по режиму опытных проб, но без добавления микробного инокулята. Во время выращивания каждые 24 часа и после окончания процесса отбирали пробы объемом 0,2 мл для определения количества живых бактерий методом серийных разведений с высевом на плотную питательную среду на основе мясопептонного агара.

После завершения процесса выращивания с помощью делительной воронки извлекали перфтордекалин и проводили экстракцию остатков нефтепродуктов хлороформом (25 см3 на весь объем среды) на шуттеле в течение 20 минут и последующей 8:10 часовой экспозицией.

Экстракты, отделяли на делительной воронке, сушили прокаленным сульфатом натрия в течение 30-40 мин., после чего отгоняли растворитель на водяной бане при температуре (75:80)°С. Пары растворителя конденсировали в холодильнике, а сам растворитель собирали в приемник. Полученные остатки после отгонки растворителя помещали в сухожаровой шкаф и при температуре (80:85)°С выпаривали до постоянной массы. Пробы после охлаждения взвешивали с точностью до 0,0001 г и рассчитывали содержание нефтепродуктов. Данные анализа массы остатков нефтепродуктов в опытной и контрольной пробах использовались для расчета степени биологической утилизации (БУ) исследуемой культурой микроорганизмов нефти и мазута по формуле:

БУ = (Мк-Мо)/Мк * 100 % , (1)

где Мк - масса нефтепродукта в исходной (контрольной) пробе (среднее арифметическое параллельных определений);

Мо - масса остатка нефтепродукта в опытной пробе (среднее арифметическое параллельных определений).

Биодеструктивную активность культур оценивали с учетом прироста количества микроорганизмов в культуральной среде и степени биологической утилизации нефтепродуктов (табл. 2-7).

Результаты экспериментов, представленные в табл. 2-7 свидетельствуют, что при отсутствии в синтетической среде углеводородов рост всех культур микроорганизмов отсутствовал, при этом первые 24-48 концентрация микроорганизмов держалась на исходном или близком к нему уровне, а затем наступало интенсивное отмирание бактерий. Внесение в среду нефти или мазута сопровождалось 6-11 кратным увеличением количества бактерий через 72-96 часов культивирования. При этом более интенсивный рост бактерий всех видов отмечался на среде с нефтью.

Таблица 2. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде в отношении нефти

Концентра-ция перфтордекалина,

%

Концентра-ция нефти,

%

Исходная концентра-ция живых микробов в см3 ´108

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после:ч роста на синтетической среде, ´108

Степень утилизации нефти,

%

24

48

72

96

 

 

 

0

0

0,9

0,8

0,8

0,6

0,5

-

 

1

0,9

1,8

5,4

10,2

9,6

8,6

 

1

0

0

0

0

0

0

 

 

1

0

0,9

1,0

1,1

0,8

0,5

-

 

1

0,9

7,7

33,5

55,4

47,6

64,5

 

1

0

0

0

0

0

0

 

 

5

0

0,9

1,1

1,2

0,7

0,3

-

 

1

0,9

9,6

47,2

56,3

42,7

94,2

 

1

0

0

0

0

0

0

 



Примечание. С целью большей наглядности результатов мы сочли целесообразным в настоящей таблице и в таблицах 3-8 привести только средние арифметические результаты по 4-6 определениям концентраций живых бактерий и степени утилизации ими нефтепродуктов. Во всех случаях степень отклонения единичного определения от средней арифметической не превышала 15 %.





Таблица 3. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде в отношении мазута

Концентра-ция перфтор-декалина,

%

Концентра-ция мазута,

%

Исходная концентра-ция живых микробов в см3 ´108

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после:ч роста на синтетической среде, ´108

Степень утилиза-ции мазута,

%

24

48

72

96

 

 

0

0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

-

 

1

0,9

1,5

3,9

8,2

8,0

5,8

 

1

0

0

0

0

0

0

 

 

1

0

0,9

1,0

1,0

0,7

0,5

-

 

1

0,9

6,2

17,3

36,8

40,3

39,7

 

1

0

0

0

0

0

0

 

 

5

0

0,9

1,1

1,1

0,6

0,3

-

 

1

0,9

8,7

39,5

48,3

39,7

73,5

 

1

0

0

0

0

0

0

 







Степень утилизации микроорганизмами нефти за четверо суток колебалась от 4,3 до 8,6%, мазута от 3,9 до 5,8%. Наибольшей биодеструктивной активностью в отношении нефти и мазута обладала культура Pseudomonas putida ВУ186, наименьшей культура Bacillus subtilis ВУ 367. Культура Rhodococcus erythropolis ВУ 321 по степени утилизации нефти и мазута занимала среднее место.

Таблица 4. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Rhodococcus erythropolis ВУ 321 в жидкой синтетической среде в отношении нефти

Концентра-ция перфтор-декалина,

%

Концентра-ция нефти,

%

Исходная концентра-ция живых микробов в см3 ´108

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после:ч роста на синтетической среде, ´108

Степень утилизации нефти,

%

24

48

72

96

 

 

0

0

0,8

0,8

0,7

0,6

0,5

-

 

1

0,8

1,5

3,9

8,2

8,0

6,3

 

1

0

0

0

0

0

0

 

 

1

0

0,8

1,0

1,0

0,6

0,4

-

 

1

0,8

6,2

17,3

36,8

40,3

39,7

 

1

0

0

0

0

0

0

 

 

5

0

0,8

1,1

1,1

0,5

0,3

-

 

1

0,8

8,7

39,5

48,3

39,7

73,5

 

1

0

0

0

0

0

0

 







Таблица 5. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Rhodococcus erythropolis ВУ 321 в жидкой синтетической среде в отношении мазута

Концентра-ция перфтор-декалина,

%

Концентра-ция мазута,

%

Исходная концентра-ция живых микробов в см3 ´108

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после:ч роста на синтетической среде, ´108

Степень утилизациимазута,

%

24

48

72

96

 

 

0

0

0,8

0,8

0,7

0,6

0,5

-

 

1

0,8

1,5

3,6

7,2

7,3

5,1

 

1

0

0

0

0

0

0

 

 

1

0

0,8

1,0

1,0

0,7

0,5

-

 

1

0,8

6,0

14,1

26,5

35,6

31,5

 

1

0

0

0

0

0

0

 

 

5

0

0,8

1,0

1,1

0,6

0,3

-

 

1

0,8

8,2

29,8

35,7

38,7

54,8

 

1

0

0

0

0

0

0

 







Внесение в культуральную среду 1 и 5% перфтордекалина во всех случаях, сопровождалось значительным ускорением роста бактерий на синтетической среде с углеводородами нефти и мазута и существенным приростом абсолютного их количества начиная с первых суток культивирования с максимумом на третьи сутки роста. При этом концентрация бактерий через трое суток роста для культуры Pseudomonas putida ВУ186 достигала 5,63*109, что превышало их исходную концентрацию в 60 раз и аналогичный показатель для данного микроорганизма на среде без перфтордекалина в 5,5 раза.

Степень утилизации нефти в средах с содержанием 1 и 5% перфтордекалина у этого микроорганизма достигала 64,5 и 94,2%, соответственно, что в 8,6 и 11 раз превышало утилизацию нефти на среде без перфтордекалина.

Таблица 6. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Bacillus subtilis ВУ 367 в жидкой синтетической среде в отношении нефти

Концентра-ция перфтордекалина,

%

Концентра-ция нефти,

%

Исходная концентра-ция живых микробов в см3 ´108

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после:ч роста на синтетической среде, ´108

Степень утилизации нефти,

%

24

48

72

96

 

 

0

0

1,1

1,2

0,9

0,9

0,7

-

 

1

1,1

1,7

3,5

7,4

7,2

4,3

 

1

0

0

0

0

0

0

 

 

1

0

1,1

1,1

1,2

1,0

0,7

-

 

1

1,1

3,7

11,5

27,5

33,7

23,9

 

1

0

0

0

0

0

0

 

 

5

0

1,1

1,2

1,1

0,7

0,6

-

 

1

1,1

6,1

18,4

29,8

32,5

41,6

 

1

0

0

0

0

0

0

 



Таблица 7. Влияние перфтордекалина на рост и биодеструктивную активность культуры Bacillus subtilis ВУ 367 в жидкой синтетической среде в отношении мазута

Концентра-ция перфтордекалина,

%

Концентра-ция мазута,

%

Исходная концентра-ция живых микробов в см3 ´108

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после:ч роста на синтетической среде, ´108

Степень утилизациимазута,

%

24

48

72

96

 

 

0

0

1,1

1,2

0,9

0,9

0,7

-

 

1

1,1

1,4

3,1

6,4

6,0

3,9

 

1

0

0

0

0

0

0

 

 

1

0

1,1

1,1

1,2

1,0

0,7

-

 

1

1,1

3,9

14,2

26,4

30,1

20,6

 

1

0

0

0

0

0

0

 

 

5

0

1,1

1,2

1,1

0,8

0,6

-

 

1

1,1

5,3

12,8

23,5

29,8

37,1

 

1

0

0

0

0

0

0

 



Существенное увеличение скорости роста микроорганизмов, абсолютной их концентрации в среде и степени утилизации нефти и мазута наблюдался при добавлении в среду перфтордекалина для всех трех исследуемых культур микроорганизмов родов Pseudomonas, Rhodococcus и Bacillus. При этом прирост их показателей был примерно пропорционален их исходной биодеструктивной активности, определенной в отсутствие перфтордекалина.

Таблица 8. Влияние перфтордекалина на рост культуры Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде с глюкозой

Концентра-ция перфтор-декалина,

%

Концентра-ция глюкозы,

%

Исходная концентра-ция живых микробов в см3 ´108

Концентрация живых бактерий в см3 в среде после:ч роста на синтетической среде, ´108

24

48

72

96

 

0

0

0,9

0,8

0,8

0,6

0,5

 

1

0,9

10,9

26,3

19,2

19,6

 

1

 

0

0,9

1,0

1,1

0,8

0,5

 

1

0,9

16,7

48,2

24,3

18,4

 

5

 

0

0,9

1,1

1,2

0,7

0,3

 

1

0,9

45,3

37,1

19,7

14,5

 



При выращивании культуры Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде, содержащей перфтордекалин и глюкозу вместо нефти или мазута, интенсивность роста бактерий резко возрастала. При этом пик концентрации живых клеток в культуральной среде с 5% перфтордекалина наблюдался уже через сутки, достигая 4,53*109 живых бактерий с последующим понижением этого показателя через двое, трое и четверо суток. В культуральной среде содержащей 1% перфтордекалина этом пик концентрации живых клеток наблюдался через двое суток культивирования с последующим интенсивным снижением этого показателя через трое и четверо суток. При росте Pseudomonas putida ВУ186 в жидкой синтетической среде с глюкозой вместо нефти или мазута, но не содержащей перфтордекалин, интенсивность роста бактерий менялась не в столь выраженной форме, однако она также превышала в несколько раз по скорости роста и интенсивности бионакопления аналогичные показатели для данного микроорганизма на средах с нефтью и мазутом. Потребность в кислороде у микроорганизмов растущих на среде с глюкозой составляет 0,7 граммов на 1 грамм абсолютной сухой массы; нефти и топочного мазута - до 3,3 граммов [4].

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о возможности использования ПФОС для наработки биомассы микроорганизмов биодеструкторов с использованием дешевых синтетических сред с добавлением углеводородов нефтепродуктов в качестве источника углерода и энергии. Была показана возможность существенной интенсификации биодеструктивной активности грамположительных и грамотрицательных бактерий разных групп при добавлении в среду культивирования перфтордекалина в концентрациях от 1 до 5%.

Не вызывает сомнений, что интродукция во внешнюю среду активированной подобным образом микрофлоры позволит более эффективно восстанавливать ее экологическое равновесие в зоне хронических загрязнений нефтью и отходами нефтепроизводств, а также ликвидировать последствия техногенных катастроф, сопровождающихся массивным выбросом нефтепродуктов. Полученные данные существенно расширяют возможности использования перфторуглеродов для удаления разнообразных экотоксикантов биотехнологическими методами [7-9].

Литература

1. Использование биогенных добавок совместно с препаратом <Деворойл> для рекультивации нефтезагрязненных почв / Габбасова И.М., Сулейманов Р.Р., Бойко Т.Ф. и др. // Биотехнология. - 2002.- ©2. - С. 57 - 65.

2. Эффективные микроорганизмы-нефтедеструкторы для биологической рекультивации почв / Логинов О.Н., Бойко Т.Ф., Артемова С.А. и др.// Тез. докл. 1-го Международного Конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 14-18 октября 2002 г.). - М.:ЗАО Максима>, РХТУ им Д. И. Менделеева, 2002. - С.294.

3. Киреева Н.А. // Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. Уфа, 1994. - 171 с.

4. Интенсификация процессов очистки воды и почвы от нефтянных загрязнений в присутствии переносчиков кислорода / Курашов В. М., Емельянов В. М., Сахно Т. В. и др. // Тез. докл. 1-го Международного Конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 14-18 октября 2002 г.). - М.:ЗАО Максима>, РХТУ им Д. И. Менделеева, 2002. - С. 293 -294.

5. Иваницкий Г. Р. Биофизические основы создания перфторуглеродных сред и газотранспортных кровезаменителей (обзор) //Сборник научных трудов НПФ <Перфторан>: Перфторорганические соединения в биологии и медицине. - Пущино: ПНЦ РАН, 2001. Вып. XI. - С. 4-48.

6. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Алпашкин Р. И. и др. Выделение и изучение прикладных свойств микроорганизмовнефтедеструкторов//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. <Наука-производство-технологии-экология>, Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.©3. С. 78-79.

7. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Золотарев А. Г., Кривошеина Н. А. Нужна ли <голубая кровь микроорганизмам>?// МВФ. Медицина. Фармация, 2003, © 2. - С. 7-11.

8. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Кривошеина Н. А. и др. Использование перфторуглеродов для интенсификации процессов микробной деградации нефти и нефтепродуктов//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. <Наука-производство-технологии-экология>, Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.©3. С. 80-81.

9. Бакулин М. К., Пименов Е. В., Дармов И. В. Зачем микроорганизмам <голубая кровь>//Сборник материалов Всероссийской науч.-техн. конф. <Наука-производство-технологии-экология>, Киров, ЦДООШШ, 2003, Т.©3. - С. 82-83.


Страница вверх
Свидетельство о регистрации сетевого электронного научного издания N 077 от 29.11.2006
Журнал основан 16 ноября 2000г.
Выдано Министерством РФ по делам печати, телерадиовещания и средств массовых коммуникаций
(c) Перепечатка материалов сайта Medline.Ru возможна только с письменного разрешения редакции

Размещение рекламы

Rambler's Top100