Патогенез интоксикации блокаторами хлор-ионофора гамк-рецепторов и поиск средств медицинской защиты

На современном этапе развития общества ежегодно синтезируются десятки тысяч новых токсичных химических соединений. Количество изученных физиологически активных веществ, свойства которых позволяют рассматривать их как потенциальные средства химического терроризма или диверсий, составляет не один десяток. И этот список будет расти даже в том случае, если в соответствии с "Конвенцией о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия (1993)" будут полностью запрещены работы по поиску активных токсикантов. Интенсивность фундаментальных и прикладных исследований физиологически активных веществ (ФАВ), проводимых в настоящее время с привлечением новейших достижений химии, фармакологии, биохимии и токсикологии, допускает возможность нахождения высокотоксичных веществ, которые могут рассматриваться в качестве потенциальных ОВ. В последние годы бурно прогрессирует одно из направлений токсикологии - исследование токсических эффектов так называемых ГАМК-литиков. ГАМК-антагонисты представляют собой химические вещества различных классов, объединяемых способностью нарушать проведение нервных импульсов в ГАМК-ергических синапсах. Эта группа включает соединения, нарушающие синтез ГАМК в центральной нервной системе, блокирующие пресинаптическое высвобождение нейромедиатора, а также действующие на уровне постсинаптической мембраны. Согласно современным представлениям их можно рассматривать как высокотоксичные вещества смертельного действия. Использование в научных исследованиях соединений этой группы обеспечило значительный прогресс в нейрофармакологии противоэпилептических, снотворных и психотропных средств. В теоретическом плане они незаменимы при анализе нейрофизиологии ГАМК-ергических структур. Наибольший интерес исследователей привлекает в качестве модельного вещества, вызывающего нарушения функции ЦНС, норборнан. Указанное соединение является неконкурентным лигандом хлор-ионных каналов ГАМКА-рецепторов, головного мозга грызунов, при этом норборнан обладает способностью необратимо блокировать хлорную проводимость. К настоящему времени, в результате выполненных работ накоплен определенный материал по оценке механизма действия ГАМК-антагонистов на организменном, клеточном и субклеточных уровнях. Несмотря на то, что многие аспекты биологической активности ГАМК-литиков остаются невыясненными, указанный класс химических веществ, несомненно, перспективен для военной токсикологии и фармакологии. Соединения данной группы отличаются высокой токсичностью и стойкостью. Для купирования симптомов интоксикации необходимо повторное введение больших доз фармакологических средств, что само по себе приводит к выраженным побочным эффектам. Очевидно, что разработка эффективных средств профилактики и терапии отравлений возможна не только на основе знания механизмов токсического действия и процессов детоксикации ядов, но и на понимании характера взаимодействия различных нейромедиаторных систем при формировании данного патологического состояния. Следует отметить, что отечественные ученые Головко А.И., Гладких В.Д., Колосова Н.А., Лошадкин Н.А., Покровская Л.А., Семенов Е.В., Чепурнов В.А. Бурякова Л.В., Пшенкина Н.Н. и другие, внесли заметный вклад в изучение молекулярных механизмов токсического действия ГАМК-литиков. ЦЕЛЬЮ НАШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ является выявление патогенетических механизмов интоксикации норборнаном и обоснование методологических подходов к поиску средств медицинской защиты при поражении неконкурентными антагонистами хлор-ионных каналов ГАМКА-рецепторов. На основе литературных данных и в результате проведенных экспериментов по изучению дозозависимых особенностей проявления интоксикации изучаемыми препаратами показано, что введение животным норборнана в диапазоне доз от 0,8 ЛД50 и выше сопровождается развитием эпилептиформного судорожного симптомокомплекса. При этом введение грызунам норборнана в дозе 0,8 ЛД50 приводит к формированию у них повышенной судорожной готовности к факторам различной природы; норборнан в субконвульсивных дозах (0,2-0,5 ЛД50) вызывает нарушение интегративных функций ЦНС, сопровождающихся расстройством мнестических и зоосоциальных форм поведения. Полученные экспериментальные данные не позволили в полной мере объяснить особенности интоксикации норборнаном: медленное развитие, выраженная фазность течения. Для выяснения токсикодинамических особенностей интоксикации блокаторами хлор-ионного канала ГАМКА-рецептора с помощью радиолигандного анализа (РЛА) изучали характер взаимодействия норборнана с хлор-ионофором (рисунок 1). В опытах in vitro синаптические мембраны больших полушарий головного мозга крыс инкубировали с ГАМК-литиками, ингибирующими хлор-ионные каналы (t-бутилбициклофосфатом, тетраметилендисульфотетрамином, пикротоксином, норборнаном). Далее мембранные препараты подвергали 5-кратному отмыванию-центрифугированию, после чего с помощью меченного тритием третбутибициклоортобензоата (3Н-ТВОВ) (специфического лиганда для хлор-ионных каналов) тестировали сохранившиеся хлор-ионофоры ГАМКА-рецепторов. Предварительная инкубация мембран с норборнаном сопровождалась значительным снижением числа хлор-ионных каналов, выявляемых радиолигандом. Даже при концентрации норборнана 16 нМ уменьшение мест связывания 3Н-ТВОВ не удавалось устранить 5-кратным отмыванием мембранного препарата. Из представленных данных видно, что норборнан, в отличие от других ГАМК-литиков, вызывал необратимое снижение числа хлор-ионных каналов, взаимодействующих с лигандом. Таким образом, в опытах in vitro удалось показать, что норборнан относится к веществам, необратимо ингибирующим хлор-ионные каналы ГАМКА-рецепторов, в то время как другие ГАМК-литики (t-бутилбициклофосфат, тетраметилендисульфотетрамин и пикротоксин) таким эффектом не обладали. На основании полученных данных, была предпринята попытка использования норборнана в субсудорожных, минимально-смертельных и смертельных дозах, в качестве модельного препарата для изучения в эксперименте патогенеза интоксикации неконкурентными антагонистами хлор-ионных каналов ГАМКА-рецепторов. В ряде научных публикаций отмечается, что при отравлении веществами судорожного действия в несмертельных дозах происходит изменение спонтанной двигательной активности и зоосоциального поведения экспериментальных животных. В исследованиях по экспериментальной оценке выраженности безусловно-мотивационных поведенческих реакций и характеристик условно-рефлекторной деятельности в условиях интоксикации неконкурентными блокаторами хлор-ионных каналов ГАМКА-рецепторного комплекса показано, что в формировании выявляемых нарушений индивидуального и зоосоциального поведения и рефлекторной деятельности грызунов при интоксикации норборнаном в дозах 0,2-0,5 ЛД50 наряду с ГАМК-ергической, вовлечены дофамин-, адрен-, холин-, опиоид- и серотонинергическая нейромедиаторные системы. Оценка, как спонтанного поведения грызунов, так и характеристик выработки и сохранения условных рефлексов при несмертельном отравлении одним из неконкурентных блокаторов хлор-ионного канала ГАМКА-рецепторов выполнена на белых беспородных крысах самцах. Моделирование несмертельного отравления осуществлялось путем внутрибрюшинного введения животным норборнана в дозе 0,2ЛД50. Контрольная группа получала эквивалентное количество растворителя. Оценка двигательной активности лабораторных животных осуществлялась в тесте "ОТКРЫТОЕ ПОЛЕ" через 2, 6, 24, 48 часов и на 5, 6 сутки от момента введения токсиканта, а оценка изменений условно-рефлекторной деятельности осуществлялась по методике выработки условного рефлекса активного избегания плаванием. В результате проведенных экспериментов по оценке спонтанной двигательной активности установлено, что изменения исследуемых показателей у крыс, отравленных норборнаном имеют выраженную фазность (рисунок 2 и 3). У животных опытной группы через 6 часов от момента введения ксенобиотика отмечалось повышение горизонтальной 34+/-3,5 (контроль 11,4+/-1,9) и вертикальной 18+/-3,1 (контроль 5+/-1,1) спонтанной двигательной активности (p<=0,05). Через 48 часов у животных получавших норборнан также регистрировалось достоверно значимое повышение горизонтальной 50,2+/-7,8 (контроль 14,6+/-5,9) и вертикальной 15,6+/-3,0 (контроль 6,4+/-1,7) спонтанной двигательной активности (p<=0,05). Изменений спонтанной двигательной активности у животных отравленных ГАМК-литиком через 2, 24 часа, на 5 и 6 сутки от момента введения токсиканта не отмечалось. Таким образом, блокатор хлор-ионных каналов ГАМКА-рецепторов норборнан при введении в дозе 0,2 ЛД50 вызывают изменения в поведении лабораторных животных, выражающиеся в повышении спонтанной двигательной активности. Фазность в проявлении интоксикации вероятно связана с особенностями токсикокинетики и токсикодинамики ГАМК-антагониста. Согласно литературным данным при воздействии необратимого блокатора хлор-ионной проводимости ГАМКА-рецепторно-канального комплекса - норборнана, наиболее уязвимыми процессами высшей нервной деятельности является функционирование узловой стадии формирования целенаправленного поведенческого акта - стадии афферентного синтеза, включающей в себя формирование мотивационного возбуждения и памяти. Величины медианно-эффективных токсодоз, вызывающие ретроградную и антероградную амнезии составляют соответственно 0,15-0,20 и 0,20-0,25 от величин медианно-смертельных токсодоз (ЛД50). В наших экспериментах оценка так называемых мнестических функций у крыс осуществлялась в водном бассейне с предварительной, до введения препаратов, выработкой пространственной ориентации (в течение 5 дней по 3 предъявлений теста в день) с дальнейшим продолжением выработки условного рефлекса после введения токсиканта (рисунок 4). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об отсутствии достоверного влияния норборнана в дозе 0,2 ЛД50 на выработку условного рефлекса активного избегания плаванием у крыс, однако выявляемая в первые 12 часов от введения токсиканта тенденция к задержке дальнейшей выработки рефлекса позволяет предполагать, что в условиях интоксикации норборнаном в субконвульсивных дозах происходит изменение интегративных функций ЦНС. Повышение двигательной активности, исследовательского поведения и нарушение мнестических функций не может быть объяснено только токсикокинетическими, да и токсикодинамическими особенностями данного токсиканта, вероятно блокада хлор-ионофоров ГАМКА-рецепторов головного мозга норборнаном приводит к формированию сложного каскада патологических процессов связанных с нарушением регуляции высших интегративных функций ЦНС млекопитающих и интимных механизмов поведенческой деятельности. На основании данных литературы и результатов собственных исследований, можно отнести норборнан к судорожным ядам медленного действия, что, по-видимому, связано с особенностями его токсикокинетики и токсикодинамики. Прочное связывание ГАМК-литика с рецепторным комплексом приводит к возникновению длительного дисбаланса нейромедиаторных процессов, что может реализоваться в формировании устойчивого состояния повышенной судорожной готовности. Исходя из вышеизложенного, была предпринята попытка использования норборнана, в субсудорожных и минимально-смертельных дозах, в качестве модельного препарата для создания в эксперименте состояния повышенной судорожной готовности. Изучалась способность яда изменять чувствительность экспериментальных животных к токсическому действию других конвульсантов и влиять на фармакологическую активность нейротропных препаратов. На фоне предварительной инъекции норборнана наблюдалось формирование повышенной судорожной готовности к бикукуллину, 3-меркаптопропионовой кислоте, пикротоксину, никотину и другим веществам. Анализ полученных данных показал, что повышение чувствительности мышей к пикротоксину после воздействия норборнаном проявляется сильнее и сохраняется дольше, в сравнении с другими использованными судорожными ядами. Это послужило основанием для создания модели повышенной судорожной готовности к пикротоксину на фоне однократного применения норборнана в дозе 0,8 ЛД50. Данная экспериментальная модель повышенной судорожной готовности у мышей с использованием норборнана используется нами для проведения изучения участия различных нейромедиаторных систем в формировании проявлений интоксикации ГАМК-литиками и первичного скрининга противосудорожных средств. Опыты выполнены на белых беспородных мышах-самцах массой 20-25 г. Животным вводили НБ в дозе 0,8 ЛД50 (0,095 мг/кг), затем через 6 часов - тестирующую дозу пикротоксина (4 мг/кг). НБ и пикротоксин растворяли в 5% диметилсульфоксиде (ДМСО) и вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл/кг. В экспериментах использовались агонисты и антагонисты NMDA-рецепторов: NMDA, (1-(1-фенилциклогексил)-пиперидин, МК-801; М-холинорецепторов: ареколин, атропина сульфат; дофаминовых рецепторов: апоморфина гидрохлорид, дроперидол (антагонист Д2-рецепторов); агонисты ГАМКБ-рецепторов: γ-оксибутират натрия, баклофен, фенибут; бензодиазепин - диазепам; сульфат магния. Исследуемые вещества растворяли в 10% р-ре ДМСО и вводили интраперитонеально в объеме 0,1 мл/кг за 10 мин до пикротоксина. При изучении влияния веществ на судорожную активность оценивались следующие показатели: время возникновения первого вздрагивания или кивания головой (судороги 1 степени), первых клонико-тонических судорог с "латерализацией" и фазой тонической экстензии (судороги 2 степени), время гибели и летальность (таблица 1). В патологии нейрона, его гиперактивации и эпилептизации велика роль NMDA-рецепторов, так как они обеспечивают усиленную и длительную активацию нейронов. Общим эффектом используемых в нашем исследовании антагонистов данного подтипа глутаматных рецепторов является уменьшение летальности животных при отсутствии статистически значимого влияния на время развития остальных параметров судорожной активности. Кроме того, (1-(1-фенилциклогексил)-пиперидин (1,2 и 10 мг/кг) дозозависимо снижает выраженность судорог, при норборнан-пикротоксиновом киндлинге (НПК), а МК-801 в дозе 2 мг/кг изменяет паттерн судорожной активности: резкое уменьшение тонического компонента, увеличение длительности судорог (более 2 часов), сокращение интериктального периода. Различия в эффектах МК-801 и (1-(1-фенилциклогексил)-пиперидина, очевидно, связаны с отличающимся фармакологическим спектром. Так, МК-801 является селективным блокатором NMDA-рецепторов, (1-(1-фенилциклогексил)-пиперидин, помимо этого механизма, активирует ?-рецепторы. Учитывая, что введение агониста N-метил-D-аспартата (50 мг/кг) вызывает судороги с выраженной фазой тонической экстензии, а также результаты экспериментов с использованием блокаторов NMDA-рецепторов, предполагается участие данных рецепторов в формировании прежде всего тонического компонента и терминального этапа судорог - опистотонуса. Сульфат магния использовался в связи с участием ионов Mg2+ в потенциалзависимой блокаде канала NMDA-рецепторов. Показано, что сульфат магния в дозах 50 и 100 мг/кг не вызывал изменения измеряемых параметров судорожной активности. Использование в экспериментах апоморфина гидрохлорида (2 мг/кг) вызывает статистически значимую задержку (p<0,05) возникновения судорог 1 степени у экспериментальных животных, а дроперидол в дозе 0,7 мг/кг, напротив, ускоряет их развитие и вызывает увеличение летальности животных. При введении дроперидола в дозе 0,07 мг/кг время развития судорог не отличается от показателей контрольной группы, однако, отмечается тенденция к увеличению летальности. Полученные результаты позволяют предположить, что активация дофаминергической нейромедиаторной системы оказывает противосудорожное влияние, опосредуемое через дофаминовые рецепторы 2-го подтипа. Анализ фармакологической модуляции холинергическими средствами показал, что ареколин (15 мг/кг) вызывает статистически значимое увеличение времени развития судорог 1 и 2 степени (p<0,01 и p<0,05, соответственно). Атропин в дозах 0,1 и 5 мг/кг не оказывает влияния на исследуемые показатели. γ-оксибутират (ГОБ), являющийся эндогенным агонистом ГАМКБ-рецепторов, в дозе 500 мг/кг, также как и диазепам (0,5 мг/кг) оказывают статистически значимое влияние на все исследуемые показатели, что свидетельствует о высокой противосудорожной активности данных соединений при судорожной активности, вызванной НПК. Выраженный противосудорожный эффект ГОБ, очевидно, обусловлен тесным взаимодействием со многими нейромедиаторными системами. Для выяснения роли ГАМКБ-рецепторов в механизме противосудорожного действия ГОБ в отдельной серии экспериментов в качестве медиаторных "зондов" были использованы баклофен (5 мг/кг) и фенибут (100 мг/кг). Баклофен статистически значимо замедлял развитие судорог 1, 2 и времени гибели животных, не влияя на летальность. При введении фенибута, кроме замедления развития судорог 1 и 2 степени, обнаружена тенденция к уменьшению летальности животных. Таким образом, противосудорожный эффект ГОБ вероятно частично опосредуется через активацию ГАМКБ-рецепторов. Не исключаются также немедиаторные влияния ГОБ на судорожную активность, связанные со способностью изменять метаболизм ЦНС. Возможность влияния метаболических эффектов на течение судорог показана нами при использовании антиоксиданта мексидола. При введении мексидола в дозе 50 мг/кг за 30 мин до пикротоксина на модели НПК обнаружена тенденция к увеличению латентного периода судорог (р=0,15) и уменьшению летальности (3/6) в сравнении с контрольной группой (5/6), статистически значимое увеличение времени развития судорог 2 степени (р=0,01), а также меньшая выраженность поведенческих проявлений судорожной активности. Таким образом, нами показано участие NMDA-, дофаминовых, М-холино-, ГАМКБ- и бензодиазепинового сайта ГАМКА-рецепторов в судорожной активности, вызванной НПК. Наиболее выраженными противосудорожными свойствами на данной модели обладают диазепам (представитель класса бензодиазепинов) и γ-оксибутират. В предварительных экспериментах по скринингу фармакологических средств на модели норборнан - пикротоксинового киндлинга нами получены результаты о противосудорожной эффективности препаратов различных групп. В последующих экспериментах на моделях смертельного отравления норборнаном оценивается эффективность выбранных препаратов при интоксикации блокаторами хлор-ионофора. В результате экспериментов получены результаты о неоднозначном влиянии противосудорожных препаратов на проявления токсического процесса при интоксикации неконкурентным антагонистом хлор-ионного канала ГАМКА-рецепторов. Интоксикация норборнаном тяжелой степени сопровождается формированием тяжелых клонико-тонических судорог у экспериментальных животных. Период развития генерализованных судорог протекает с выраженным расстройством жизненно-важных функций организма характеризуется латеропульсией, зачастую с вокализацией и развитием тонических судорог, которые либо сразу, либо через незначительный межсудорожный период, переходят в клонические судороги. В дальнейшем у лабораторных животных развиваются пароксизмы клонико-тонических судорог чередующиеся межсудорожными промежутками. При этом обращали на себя внимание выраженное расстройство дыхания и саливация. Гибель лабораторных животных отмечается на пике клонико-тонических судорог в фазе тонического сокращения. В случае выздоровления некоторое время могут сохраняться расстройства координации движения и равновесия. Мышечное напряжение и сильные звуковые раздражители могут провоцировать возникновение повторных судорожных сокращений. Для купирования симптомов интоксикации необходимо повторное введение больших доз фармакологических средств, что само по себе приводит к выраженным побочным эффектам. Поиск средств эффективной профилактики и лечения судорожного синдрома при отравлении норборнаном представлялось обоснованным начать среди классических антиконвульсантов. В предварительных экспериментах по скринингу фармакологических препаратов обладающих противосудорожной активностью на модели норборнан - пикротоксинового киндлинга получены результаты об эффективности ряда нейротропных препаратов, в том числе и бензодиазепинового ряда, проявляющейся в снижении повышенной судорожной готовности к пикротоксину формирующейся под действием норборнана. Изучение влияния диазепама, феназепама, кетамина в дозе 5 мг/кг и ГОМК в дозе 300 мг/кг на проявления интоксикации норборнаном в дозе 0,2 и 0,3 мг/кг проводилось на белых беспородных крысах самцах массой 130-150 г. Судорожную активность оценивали по методу Г.Н. Крыжановского и соавторов (1985) и Дж. Оно и соавторов (1990) в нашей модификации. Все вещества животные получали интраперитонеально, нейротропные препараты с профилактической целью вводились за 10 минут до норборнана, а с лечебной при первых судорожных паттернах (таблица 2 и 3). Применение диазепама с профилактической целью за 10 минут до норборнана не влияло на время начала судорожных реакций, однако приводило к модификации клинической картины интоксикации проявляющейся в снижении интенсивности судорог у животных (единичные клонические судороги конечностей), развитии коматозного состояния и гибели животных в более ранние сроки по сравнению с контролем на 17,1 +/-0,8 мин (р?0,05). В контроле гибель животных отмечалась на 69+/-5,4 мин. с момента введения токсиканта. Введение диазепама с лечебной целью, при первых судорожных паттернах, также приводило к резкому снижению интенсивности судорожных проявлений, но провоцировало быстрое развитие комы и гибели животных на 25,5+/-3,6 мин (p<=0,05). Профилактическое введение феназепама за 10 минут до норборнана удлиняло время начала судорожных реакций у экспериментальных животных, однако сопровождалось развитием коматозного состояния и гибелью животных в более ранние сроки по сравнению с контролем на 17,1 +/- 0,8 мин (р?0,05). Происходила модификация клинической картины интоксикации проявляющаяся в снижение интенсивности судорог у животных (единичные клонические судороги конечностей), отмечались фасцикуляции. В контрольной группе гибель животных отмечалась на 87,3 +/- 17,7 мин. с момента введения токсиканта. Введение феназепама с лечебной целью, при первых судорожных паттернах, на фоне интоксикации норборнаном, также приводило к резкому снижению интенсивности судорожных проявлений, но провоцировало быстрое развитие комы и гибели животных на 20,7 +/- 1,3 мин (p<=0,05). Полученные результаты, вероятно, связаны со способностью бензодиазепинов модулировать рецепцию лигандов хлор-ионного канала, что, возможно, приводит к увеличению вероятности и скорости взаимодействия молекулы токсиканта и хлор-ионофора. Эффективность бензодиазепинов в модели норборнан-пикротоксинового киндлинга, видимо, связана со способностью диазепама и феназепама снижать повышенную судорожную готовность у животных к пикротоксину формирующуюся на фоне интоксикации норборнаном в дозе 0,8 ЛД50. ВЫВОДЫ: 1. Использование в экспериментах необратимых блокаторов хлор-ионофора ГАМК-рецепторов в качестве модельных веществ позволяет формировать у лабораторных животных ряд типических патологических состояний. 2. Созданные модели могут быть использованы для изучения: - процессов формирования патологических состояний, - степени заинтересованности различных нейромедиаторных систем при интоксикации ГАМК-литиками, - для раскрытия механизмов действия судорожных ядов с целью оптимизации поиска и разработки медицинских средств защиты, а также для изучения взаимосвязи между медиаторными системами в ЦНС.

Список литературы