Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния норборнана в широком диапазоне доз на центральную регуляцию физиологических функций у лабораторных животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты были выполнены на белых беспородных мышах-самцах и крысах самцах разводки питомника РАМН п. Рапполово. До начала эксперимента животные не менее двух недель содержались на стандартном пищевом рационе вивария. За 24 часа до опытов кормление животных, находившихся на свободном водном режиме, прекращали.
В опытах ex vivo с помощью радиолигандного анализа [3] оценивали влияние норборнана на хлор-ионные каналы ГАМК-рецепторов мозга мышей.
Изучение динамики изменения массы тела, пищевого поведения и потребления воды при интоксикации норборнаном в несмертельных дозах (0,5 ЛД50) проводилось с использованием метаболических камер фирмы "Nalgene" (Италия) [7]. Ежедневно фиксировали вес грызунов, количество потребленной пищи, воды, и объем выделенной мочи.
Исследование влияния ГАМК-литика в дозе 0,8 ЛД50 на потребление кислорода экспериментальными животными осуществлялось закрытым камерным методом в аппарате Regnault. Во время респирометрии животных не фиксировали. Продолжительность измерения составляла 5 мин. Результат выражали в мл кислорода на 1 кг массы тела в 1 мин.
Определение потребления кислорода гомогенатами проводили манометрическим методом Умбрейт В.В. (1951) в аппарате Варбурга Wa 0110 фирмы Glaswerke Ilmenau (Германия) при температуре 37оС.
Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 5,5. В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего. Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оценивали по t-критерию Стъюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В экспериментах ex vivo установлено, что при системном введении норборнана в дозе 0,1 мг/кг, не вызывающей судорог в период исследования (30 мин) выявлялось необратимое угнетение хлор-ионных каналов в целом мозге мышей, которое проявлялось в уменьшении плотности ионофоров. При введении яда в дозах 0,4 - 0,5 мг/кг у отдельных мышей развивалась судорожная активность 4-й степени (повторные приступы клонико-тонических судорог с падением животного на бок). При этом плотность хлор-ионных каналов была снижена на 49 % (доза 0,4 мг/кг) и 73 % (доза 0,5 мг/кг). Полученные результаты свидетельствуют о необратимом ингибировании норборнаном рецепторов - мишеней как in vitro, так и in vivo и соответствуют современным представлениям в соответствии с которыми судороги при интоксикации ГАМК-литиками развиваются после блокады не менее половины хлор-ионофоров в ЦНС [8].
Установлено, что клиническая картина отравления норборнаном носит выраженный дозозависимый характер. Наиболее четко явления интоксикации прослеживаются при отравлении ядом в дозе 1,0 ЛД50 [3, 5, 6, 7]. В первые часы после введения токсиканта развиваются первые признаки интоксикации, проявляющиеся снижением спонтанной двигательной активности с развитием адинамии. Характерные симптомы отравления развивались через 2-3 часа после введения норборнана. У животных отмечались признаки беспокойства, агрессивности в ответ на механические раздражители, клонико-тонические судороги продолжительностью 20-30 секунд, а к исходу первых суток интоксикации развивались параличи задних конечностей. Смерть животных регистрировалась на высоте судорог, которые принимали тонический характер. На вторые сутки поведение отравленных животных визуально мало отличалось от здоровых, за исключением случаев попыток садки по отношению к партнеру-самцу ("гомосексуальное" поведение), которые фиксировались примерно у 30-40% животных. На 2-3 сутки имело место возобновление судорожных пароксизмов, которые в некоторых случаях заканчивались летальным исходом.
На 3 сутки у части выживших животных наблюдалась агрессивность, проявляющаяся атаками противника (с укусами, ударами, толчками) (рисунок 1), которая продолжалась в течение всего периода контакта животных. Наиболее характерными были позы боксирования (рисунок 2) и "полная агрессивная поза" (нападающее животное над побежденным лежащим на спине; рисунок 3). При этом наблюдались глубокие укусы в области головы, шеи и морды. Если в данной ситуации не изолировать крыс, возможны случаи убийства противниками друг друга. Наряду с высокой внутривидовой агрессивностью отмечалась агрессивность по отношению к экспериментатору: животные пытались укусить при попытке взять их из клетки. Состояние патологической агрессии сохранялось в течение 48 часов. С 5-х суток начинался процесс нормализации поведения, однако повышенная спонтанная агрессивность сохранялась еще 5-7 дней. В свою очередь у животных, отравленных норборнаном в дозе 0,5 ЛД50 и ниже, случаев спонтанной агрессивности зафиксировано не было. В этих группах также не было зарегистрировано развитие парезов и параличей задних конечностей. Однако на 2-5 сутки отмечались выраженные поведенческие нарушения, проявлявшиеся повышенной возбудимостью и усилением спонтанной двигательной активности.
рис. 1
рис. 2
рис. 3
Таким образом, у крыс, отравленных норборнаном в дозе 1,0 ЛД50 отмечалась стадийность развития интоксикации, в которой можно выделить следующие периоды: начальный, развития генерализованных клонико-тонических судорог с выраженными расстройствами жизненно важных функций организма, исходов и остаточных явлений. Полученные результаты соответствуют данным других авторов [5], выделяющих несколько форм течения интоксикации норборнаном. Так психотическая форма характеризуется расстройством эмоционально-мотивационных и мнестических функций, развивается при отравлении субконвульсивными дозами токсиканта, либо на уровне конвульсивных доз - определяет симптоматику начального периода интоксикации. Для судорожной, характерно развитие эпилептиформного симптомокомплекса, сопровождающегося экстрапирамидной недостаточностью, эмоционально-вегетативными расстройствами, пароксизмами клонико-тонических судорог и нарушением жизненно важных функций организма. Апоплексическая (молниеносная), проявляющаяся стремительным развитием генерализованных клонико-тонических судорог и ранней гибелью на фоне судорожного пароксизма.
Следует также отметить, что при отравлении норборнаном во всем испытанном диапазоне доз происходило снижение массы тела грызунов в течение всего периода наблюдения (рисунок 4).
рис. 4
Установлено, что масса тела крыс, отравленных норборнаном в дозе 0,5 ЛД50, уменьшалась в течение всего эксперимента. Так, через сутки вес грызунов снижался на 4% (р?0,05), через 3 суток - более чем на 8% (р?0,01), в период с 4 по 9 сутки в среднем на 0,6% в сутки, так что к 9 суткам потеря массы тела в опытной группе достигала 12% (р?0,01). Масса тела животных контрольной группы в течение 1-9 суток была стабильной, а имеющие место суточные колебания этого показателя статистически не значимы (р?0,05).
Потребление пищи у крыс опытной группы по сравнению с контрольными животными через 24 и 48 часов уменьшалось на 84% и 83%, соответственно (р?0,01), а на 3-5 сутки резко увеличивалось. Так, через 72 часа с момента отравления количество съеденной пищи в опытной группе достоверно повышалось в 2,6 раза, а через 120 часов - в 4,5 раза по сравнению со 2 сутками. Однако количество потребляемой животными пищи опытной группы оставалось ниже чем в контрольной, к 9 суткам эта разница составляла 20% (р?0,05) (рисунок 5).
рис. 5
Объем потребляемой воды через 24 часа после инъекции норборнана уменьшался на 82% по сравнению с контролем, а на 2-4 сутки этот показатель достоверно увеличивался в 1,9 и 4,7 раза, соответственно, по отношению к 1 суткам. На 4-9 сутки питьевой режим в опытной группе стабилизировался, однако объем выпиваемой воды сохранялся на более низком уровне, чем у контрольных животных. Так, на 9 сутки крысы, перенесшие интоксикацию норборнаном, потребляли воды на 8% меньше, чем интактные животные (р?0,05) (рисунок 6).
рис. 6
Объем выделяемой мочи в опытной группе через 24 часа уменьшался в 1,2 раза по сравнению с контролем. На 2 - 3 сутки после введения норборнана у крыс отмечали снижение выделения мочи в 2,4 - 2,5 раза, а на 4-5 сутки статистически значимо увеличивалось по сравнению с 3 сутками в 1,5 и 2,4 раза, соответственно. На 6-9 сутки объем выделяемой мочи колебался в пределах 6,5-7,3 миллилитров (рисунок 7).
Необходимо отметить, что у крыс опытной группы на 5-9 сутки в 78% случаев моча приобретала темно-коричневый цвет (цвет мясных помоев).
рис. 7
На основании полученных экспериментальных данных позволяющих предположить влияние норборнана на функции различных органов и систем, представлялось обоснованным исследовать влияние ГАМК-литика в дозе 0,8 ЛД50 на потребление кислорода животными.
Установлено, что при интоксикации норборнаном после незначительного и кратковременного увеличения (на 8 %) наблюдалось снижение потребления кислорода, достигающее стабильного уровня к концу 2 часа и составляющее 25-30 % (р?0,05) от контроля. В последующем, сохранялось стабильное угнетение потребления кислорода, и только через сутки отмечалась тенденция к восстановлению исследуемого показателя. К концу вторых суток потребление кислорода животными восстанавливалось до контрольных величин.
Влияние норборнана на аэробную подсистему энергетического обмена проводилось по интенсивности потребления кислорода гомогенатами головного мозга в опытах in vitro.
Потребление кислорода гомогенатами тканей головного мозга при воздействии норборнаном в широком диапазоне концентраций оставалось стабильным, составляя в среднем 0,54+0,04 мкл/мгткани Х час. Внесение в инкубационную среду сукцината приводило к увеличению потребления кислорода на 136-152%. Значимых различий данного показателя между экспериментальными группами выявлено не было (р?0,05).
Исследование влияния норборнана на интенсивность и реактивность клеточного дыхания позволило заключить, что в основе нарушения утилизации кислорода целостным организмом, по-видимому, лежат системные нарушения регуляции дыхания, а не первичное повреждение аэробного звена энергетического обмена.
Таким образом, необратимое ингибирование хлор-ионной проводимости в ГАМК-ергической нейромедиаторной системе является основополагающим пусковым звеном в развитии каскада патологических процессов начиная от сбоя высших интегративных функций ЦНС и заканчивая срывом неспецифических защитных механизмов.
Список литературы
1. Гладких В.Д., Колосова Н.А., Лошадкин Н.А. Особенности токсического действия ГАМК- антагонистов "клеточной" структуры норборнанового ряда / Токсикол. вестник. - 1995. -N2. -C. 10-13.
2. Гладких В.Д., Колосова Н.А., Лошадкин Н.А. Эффекты совместного действия "бициклогептана" с другими физиологически активными веществами / Токсикол. вестник. -1995. -N6. -С. 12-16.
3. Головко А.И., Головко С.И., Зефиров С.И., Софронов Г.А. Токсикология ГАМК-литиков. -СПб. : Нива, 1996. -144 с.
4. Головко А.И., Софронов Г.А., Клюнтина Т.В. Норборнан - новый необратимый лиганд хлорионных ГАМКа - рецепторов / Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1996. -N4. -С. 444-446.
5. Гладких В.Д., Колосова Н.А. К патогенезу интоксикации конвульсантами "клеточной структуры" /Токсикол. вестник. -2000. -N2. -С. 11-16.
6. Гладких В.Д., Колосова Н.А. Особенности проявления токсического действия экзо, цис-5,6-дихлор-2,2-дициан 3,3-бис(трифторметил)-бицикло/2,2,1/ гептана при многократном поступлении в организм /Токсикол. вестник. -2000. -N3. -С. 16-20.
7. Свидерский О.А., Головко А.И., Иванов М.Б., Софронов Г.А. Изменение пищевого (питьевого) поведения крыс при интоксикации норборнаном/ Сборник III-го Российского национального конгресса "Человек и лекарство".-М., 1996.-С.285.
8. Casida J.E., Nicholso R.A., Palmer C.J. Trioxabicyclooctanes as probes for the convulsant site of the GABA-gated chloride channel in mammals arthropods / Neurotox 88 : Mol . Basis Drung and Pestig. Act. -Amsterdam etc., 1988. - P. 125-144.
9. Farrant M., Webster R.F. GABA antagonists: Their use and mehanisms of action /Drugs as Tools Neurotransmitter Res. - Clifton (N.J.), 1989. -P. 161-201.
10. Moody E.J., Lewin A.H., de Costa B.R. et al. Site-specific acylation of GABA-gated Cl- uptake /Eur. J. Pharmacol. -1991. -Vol. 206, N2. -P. 113-118.