Российская поисковая система Искать:		Medline - международная поисковая система		Medinfo.ru научно-популярный медицинский журнал

Опубликовать статью

Информационное партнерство

Инфоресурсы

Контакты

Соломон Абрамович Нейфах (1909-92), член-корреспондент РАМН, был выдающимся ученым, сочетающим широкую эрудицию и интуицию в формулировании оригинальных идей и прогнозировании новых направлений научных исследований. Широко известна его деятельность как органзатора фундаментально-медицинских исследований - он активно участвовал в возрождении медицинской генетики в 60-х гг., организовал два Всесоюзных симпозиума, имевших большое значение для консолидации генетических исследований в нашей стране, создал одну из первых в стране лабораторий биохимической генетики, ставшую в последствии ядром Отдела молекулярной генетики ИЭМ и имеющей в настоящее время статус ведущей научной школы России.
Под руководством Нейфаха были организованы два симпозиума по генетическим функциям органоидов цитоплазмы, труды которых были опубликованы под его редакцией [1-3]. Менее известно широкой научной общественности идейное наследие этого замечательного ученого. Это связано с тем, что многие идеи, сформулированные Нейфахом, существенно опережали свое время и лишь сейчас становится ясной их плодотворность и перспективность. Кроме того, Нейфах был ученым, характеризовавшимся высокой требовательностью к своим публикациям, и поэтому не все его литературные планы были реализованы, а многие мысли высказывались только в устных докладах, лекциях, на лабораторных семинарах и в беседах с сотрудниками. Поэтому экспериментальное подтверждение идей Нейфаха не всегда можно сопроводить цитированием первоисточников. Иногда такое подтверждение является объективным отражением развития некоторых научных направлений, предсказанных Нейфахом, но не индуцированных его идеями непосредственно. Наша статья - это первая попытка проследить развитие некоторых направлений исследований, сущность которых была предсказана Нейфахом.
В 50-хгг. Нейфах в руководимой им лаборатории энзимологии Отдела биохимии ИЭМ исследовал механизмы регуляции энергетического обмена нормальной и раковой клетки. Он выполнил классические и общепризнанные работы по идентификации стадий гликолиза, лимитирующих его общую скорость, и показал, что направленные воздействия на эти стадии может оказать влияние на гликолитическую активность клеток. На основании результатов своих экспериментов Нейфах сформулировал ряд общих положений о закономерностях регуляции активности полиферментных цепей, катализирующих многостадийные метаболические пути, о существовании ряда уровней регуляции в этих системах (о регулируемой и максимальной скорости гликолиза) и о роли синтеза белков-ферментов как важного фактора контроля скорости гликолиза. Эти идеи были подтверждены в исследованиях, установивших взаимосвязи между активацией синтеза гексокиназы - скорость-лимитирующего фермента гликолиза и повышенной скоростью гликолиза в раковой клетке. Они суммированы в сборнике трудов симпозиума <Фосфорилирование и функция> [4], состоявшегося в ИЭМ в 1958г.
Нейфах был основоположником нового для 50-х гг. научного направления, исследующего роль компартментализации клетки в регуляции метаболизма (на модели взаимоотношений дыхательной системы митохондрий и системы гликолиза в растворимой фракции клетки). В основу исследова- ния была положена совершенно новая в то время идея о динамических обратимых изменениях проницаемости митохондриальных мембран для факторов (коферментов и белков-регуляторов), контролирующих скорость гликолиза в клетке [5] в зависимости от баланса макроэргических соединений. Именно это обусловило принципиальное отличие экспериментов, проводимых под его руководством, от других исследований в различных лабораториях мира.
В дальнейшем Нейфах обобщил и суммировал свои представления о механизмах метаболического контроля в теоретической статье в коллективной монографии <Механизмы интеграции клеточного обмена>, (1967) и затем вышедшей в дополненном виде в Польше [6,7]. В этой работе формулируются представления о трех типах механизмов регуляции метаболизма, оперирующих на уровнях изостерического и аллостерического контроля активности лимитирующих ферментов, внутриклеточной компартментализации ферментов и метаболитов, а также генетической регуляции синтеза ферментных белков.

В начале 1960-х гг. Нейфах развернул широкомасштабные исследования митохондриальной ДНК (мтДНК). Предпосылками к их проведению были следующие соображения:
1) мтДНК является генетически активной структурой и кодирует специфический набор белков митохондрий;
2) белки-продукты генов мтДНК функционируют как структурные матрицы высших порядков для сборки мультиферментных ансамблей дыхательной цепи и сопряженного фосфорилирования, т.е. своего рода морфогенетические белки;
3) в основе некоторых наследственных болезней, передающихся исключительно по материнской линии, лежат мутации мтДНК. В лаборатории Нейфаха была детально охарактеризована мтДНК животных тканей, изучена ее транскрипция и система трансляции митохондрий (рибосомы, полирибосомы, транспортные РНК), т.е. доказана генетическая активность мтДНК.
Эти результаты были подтверждены в дальнейших исследованиях ряда лабораторий, в которых была определена полная нуклеотидная последовательность мтДНК человека, мыши, крысы, дрозофилы и других видов и идентифицированы белок-кодирующие гены на циркулярной карте мтДНК. Далее, было показано, что митохондриальные гены кодируют гидрофобные субъединицы комплексов I, III, IV и V дыхательной цепи, которые необходимы для сборки функционально активных комплексов из субъединиц, кодируемых как мтДНК, так и хромосомными генами [8]. Концепция морфогенетических белков нашла подтверждение в многочисленных работах, обнаруживших многокомпонентную систему, которая обеспечивает импорт в митохондрии белков - продуктов ядерных генов и их адекватную локализацию в митохондриях. Обнаружены также морфогенетические белки, необходимые для сборки лизосом, пероксисом, ядерного хроматина и других структур клетки, и белки-шапероны, участвующие в адресованной доставке белков в специфические компартменты клетки [9]. Идея о роли мутаций мтДНК как молекулярной основы болезней, наследуемых по материнской линии (в 60-х гг. было описано единственное заболевание такого рода - Леберовская нейропатия зрительного нерва), получила развитие и прямое подтверждение в молекулярно-генетических исследованиях, в которых были описаны многочисленные мутации мтДНК, ассоциированные с большим количеством (более 20) клинических синдромов [8].
Нейфах одним из первых сформулировал представления о гетерогенности наследственных болезней, имеющей либо мультилокусную, либо мультиаллельную природу [10]. В первом случае речь идет о том, что мутации различных локусов генома могут вызывать одну и ту же или сходную фенотипическую картину. В настоящее время накоплен достаточный фактический материал, подтверждающий это предвидение [11]. Второй вариант гетерогенности наследственных дефектов обусловлен наличием различных мутаций в пределах одного гена, нарушающих функции этого гена и его белкового продукта и вызывающих сходные биохимические и клинические аномалии. Следует подчеркнуть, что эти предсказания были сделаны в 1973г., т.е. при почти полном отсутствии информации о нуклеотидных последовательностях нормальных генов и их мутантных аллелей. В дальнейшем произошел революционный методический прорыв и появилась возможность прямого химического анализа структуры генов и дедуктивного определения аминокислотных последовательностей и функциональных аномалий мутантных белков (так называемая <обратная генетика>). Оказалось, что практически каждая форма наследственной патологии характеризуется резко выраженной молекулярно-генетической гетерогенностью и имеет в основе множественные мутации различных типов, локализованные в пределах одного гена и вызывающие выраженные в разной степени клинические манифестации. Число таких мутаций для некоторых нозологических форм (муковисцидоз, семейная гиперхолестеринемия, мышечная дистрофия Дюшена и др.) достигает нескольких сотен. Разнообразны и типы изменений структуры мутантных аллелей (полные или частичные делеции генов, короткие делеции или инсерции со сдвигами рамки считывания, точковые нуклеотидные замены, инсерции, инверсии генов, нарушения структуры сигналов экспрессии и др.). В функциональном отношении мутантные аллели генов без изменения их кодирующих последовательностей могут быть разделены на нуль-аллели (полное отсутствие белка-продукта) и плюс-аллели (частичная количественная недостаточность белка). В ряде случаев степень количественного или функционального дефицита белка - генного продукта коррелирует с тяжестью клинического фенотипа заболевания, но такая взаимосвязь прослеживается не всегда. Различные варианты взаимо-отношений генотип-фенотип, трактуемые в рамках формально-генетических представлений, глубоко проанализированы в работах Нейфаха [10]. В настоящее время вариабельность взаимоотношений между генотипом и фенотипом наследственных болезней на молекулярном уровне может быть конкретизирована в рамках представлений о транс-действующих мутациях (недостаточность экспрессии гена вследствие мутаций в другом гене, кодирующем транс-действующий компонент системы экспрессии) и о супрессиях генных мутаций, исправляющих аномальный фенотип [9]. Эти представления конкретизированы и развиты в ряде исследований школы Нейфаха [12, 13].
В начале 70-х гг. Нейфах стал горячим сторонником концепции заместительной генной терапии наследственных болезней как единственного радикального способа их лечения. В то время некоторые исследователи относились к этой концепции как к научно-фантастическому выражению несбыточных надежд, не имеющих реальных шансов на практическое воплощение в ближайшем и отдаленном будущем. Действительно, предпосылки к развитию генной терапии в то время были ограниченными (химический синтез генов, отдельные работы по трансформации клеток животных и человека). Все эти факты блестяще систематизированы в обзорной статье Нейфаха [10], в которой также теоретически рассмотрены возможные показания и противопоказания к генной терапии индивидуальных нозологических форм моногенных наследственных болезней, структурно- функциональные требования к трансплантируемым генам, потенциальные опасности трансплантации генов и даже морально-этические проблемы пересадки генов. Все эти обобщения сделаны в 1973 г., т.е. до появления арсенала методов молекулярного клонирования, разработки экспрессионных векторных конструкций и способов доставки генов в клетки. Успехи генной терапии и темпы ее прогресса хорошо известны, равно как и нерешенные проблемы генной коррекции наследственных и ненаследственных дефектов.

В той же работе Нейфах суммировал итоги исследований его сотрудников, в которых выявлена малая специфичность митохондриального аппарата транскрипции и трансляции и его потенциальная способность к реализации чужеродной генетической информации. На основании этих данных Нейфах предположил, что мтДНК может служить вектором для переноса в реципиентные клетки гетерологичной генетической информации, а аппарат транскрипции-трансляции митохондрий, имеющий ряд структурно- функциональных характеристик прокариотических генетических систем, можно использовать в генной терапии как своего рода адаптерную систему для экспрессии чужеродных генов. Дальнейшие исследования Нейфаха и его сотрудников действительно показали, что фрагмент мтДНК животных, содержащий участок инициации репликации (origin) и промоторы, является универсальным челночным вектором, функционирующим как в бактериальных, так и в эукариотических клетках. В модельных опытах на субмитохондриальной системе бесклеточного синтеза белка была продемонстрирована матричная активность различных мРНК, в частности, РНК вирусов животных и растений, мРНК церулоплазмина и РНК бактериофага MS2. Оказалось, что все эти РНК программируют в митохондриальной системе синтез специфических полипептидных продуктов, обладающих функциональной активностью. Наиболее подробно была изучена трансляция РНК фага MS2. В ходе этих исследований были получены доказательства переноса геномной фаговой РНК в митохондрии и индукции синтеза специфических белков-продуктов трансляции полицистронной MS2-мРНК в них, а также в митохондриальном лизате в присутствии тРНК бактерий. С помощью селективного мечения и специфических ингибиторов разных этапов трансляции было показано, что фаг MS2 в митохондриях разворачивает свою генетическую программу в той же последовательности, как и в бактериях. Так, первым продуктом трансляции фаговой мРНК является специфическая РНК-полимераза, которая обеспечивает транскрипцию и репликацию фаговой РНК. Только затем начинается синтез белка оболочки. Удалось продемонстрировать, что в митохондриях, так же как и в бактериях, имеет место регуляция трансляции ранних и поздних генов бактериофага белковыми продуктами, в частности, угнетение трансляции фаговой РНК избытком белка оболочки. Наконец, было показано, что митохондриальный аппарат трансляции распознает нонсенс-мутации в РНК фага MS2 (amber-мутацию в гене белка оболочки) и осуществляет супрессию этой мутации в присутствии тРНК, выделенной из супрессорных штаммов E. coli. Таким образом, митохондриальные рибосомы точно транслируют информацию, записанную с помощью универсального генетического кода. Это заключение полностью подтвердилось анализом новосинтезированного белка оболочки фага MS2 методом одномерных пептидных карт в полиакриламидном геле.
В связи с частичными отклонениями митохондриального генетического кода от универсального триплетного кода возникает проблема супрессии этих <аномалий> кодирования при трансляции в митохондриальной системе гетерологичных мРНК. Решение этой проблемы в описанных выше опытах было достигнуто включением в систему трансляции набора тРНК из бактерий, способных декодировать универсальный код. Другой подход к адаптации митохондриальной системы к экспрессии чужеродных генов наметился в исследованиях последних лет [14,15], посвященных разработке путей генной терапии наследственных дефицитов митохондриальных белков. В этих работах было осуществлено конструирование полусинтетического ядерного гена для митохондриального фермента орнитинтранскарбамилазы с модификациями некоторых кодонов, приводящими к их оптимизации для декодирования в митохондриальной системе. Таким образом, идея об использовании митохондрий как адаптера для интеграции и экспрессии экзогенных генов находит свое воплощение и развитие в современных исследованиях, направленных на генную терапию митохондриальных болезней.

ЛИТЕРАТУРА
1. Нейфах С.А. (ред.)Генетические функ. органоидов цитоплазмы. Л., 1974.
2. Нейфах С.А. (ред.) Молекулярная генетика митохондрий. Л., 1977.
3. Mol., Cell. Biochem., 1977, 14, c 1-3
4. Нейфах С.А. (ред.) Фосфорилирование и функция. Л., 1961.
5. Neifakh S.A., Avramov I.A., Gaitskhoki V.S. et al.// Biochim. et Biophys. Acta, 1965, 100, 264-272.
6. Нейфах С.А. (ред.)Механизмы интеграции клеточного обмена. Л., 1967
7. Neifakh S.A. Mechanizmy integracji przemian komorkowych. Warszawa, P.W.N., 1973.
8. Wallace D.G. //Ann. Rev. Biochem., 1992, 61, 1175-1212.
9. Гайцхоки В.С.// Соросовский Образовательный Журнал, 1998, c 8, 36-41.
10. Нейфах С.А.// Журн. Всес. Хим. О-ва им. Д.И. Менделеева, 1973, 18, c 2, 125-136.
11. Гайцхоки В.С.// Вопр. Мед. Химии, 1997, 43, c 5, 290-297.
12. Нейфах С.А., Гайцхоки В.С.// Вестник АМН СССР, 1990, c 11, 42-47.
13. Гайцхоки В.С.// Вестник РАМН, 1998, c 1, 11-14.
14. Wheeler V.C., Prodromou C., Pearl L.H. et al.//Gene, 1996, 169, c 2, 251.
15. Wheeler V.C., Aitken M., Coutelle Ch. //Gene, 1997, 198, c 1-2, 203-209.